„Ziehl-Neelsen Stain“ fondas, reagentai ir technika

The Ziehl-Neelsen dėmė dažymo metodu, kad būtų galima nustatyti atsparius alkoholiui rūgštims atsparius mikroorganizmus (AAR). Šios mikrobiologijos procedūros pavadinimas nurodo jo autorius: bakteriologas Franz Ziehl ir patologas Friedrichas Neelsenas..

Šis metodas yra diferencinės spalvos tipas, kuris reiškia skirtingų dažiklių naudojimą, kad būtų sukurta kontrastas tarp struktūrų, kurias norite stebėti, diferencijuoti ir vėliau identifikuoti. Ziehl-Neelsen dažai naudojami tam tikrų tipų mikroorganizmams nustatyti.

Kai kurie iš šių mikroorganizmų yra mikobakterijos (pavyzdžiui,, Mycobacterium tuberculosis), nocardias (pavyzdžiui,. \ t, Nocardia sp.) ir kai kurių vienaląsčių parazitų (pvz.,, Cryptosporidium parvum). Daugelis bakterijų gali būti klasifikuojamos taikant įprastą metodą, vadinamą „Gram“.

Tačiau kai kurioms bakterijų grupėms jų identifikavimui reikalingi kiti metodai. Tokie metodai kaip „Ziehl-Neelsen“ dažymas reikalauja dažų ir šilumos derinių, kad būtų galima pritvirtinti pirmąją prie ląstelės sienelės.

Tada atsiranda spalvos pakitimo procesas, leidžiantis pasiekti du rezultatus: atsparumą ar jautrumą spalvų pakitimui rūgštimis ir alkoholiais.

Indeksas

• 1 Fondas
  • 1.1 Antrinė spalva
• 2 Reagentai
  • 2.1 Pirminis dažymas
  • 2.2
  • 2.3 Antrinė spalva (anti-dažiklis)
• 3 Technika
  • 3.1. Rūgštinio dažymo procedūra
• 4 Nuorodos

Fondas

Šio dažymo metodo pagrindas yra šių mikroorganizmų ląstelių sienelių savybės. Sieną sudaro riebalų rūgščių rūšis, vadinama mikolio rūgštimis; Joms būdingos labai ilgos grandinės.

Kai riebalų rūgštys turi labai ilgas struktūras, jos gali lengviau išlaikyti dažus. Dėl didelės mikolio rūgšties kiekio ląstelių sienelėje kai kurių bakterijų genų dažymas yra labai sunkus.

Ziehl-Neelsen dėmėje naudojamas fenolio junginys karbolio fuksinas, pagrindinis dažiklis. Tai turi galimybę sąveikauti su ląstelių sienelės riebalų rūgštimis, kuri yra vaškinė tekstūra kambario temperatūroje.

Karbolio fuchsino dažymas pagerėja esant šilumai, nes vaškas lydosi ir dažų molekulės sparčiau juda į ląstelės sienelę.

Vėliau naudojama rūgštis padeda ištepti neužkrėstas ląsteles, nes jų siena nebuvo pakankamai susijusi su dažikliu; todėl rūgšties spalvos sumažinimo priemonė gali pašalinti rūgštinį dažą. Ląstelės, kurios priešinasi šiam spalvos pakitimui, vadinamos atsparios rūgštims.

Antrinė spalva

Po mėginio spalvos pasikeitimo, tai yra priešinga kitam dažui, vadinamam antriniu dažikliu. Paprastai naudojamas metileninis arba malachitas.

Antrinis dažiklis dengia foninę medžiagą, todėl sukuria kontrastą su pirmuoju etapu dažytomis struktūromis. Tik spalvos ląstelės absorbuoja antrąjį dažiklį (apsaugo nuo dėmių) ir ima jų spalvą, o rūgštims atsparios ląstelės išlaiko raudoną spalvą.

Ši procedūra dažnai naudojama nustatant Mycobacterium tuberculosis ir Mycobacterium leprae, kurios vadinamos rūgštingomis bacilėmis.

Reagentai

Pirminės spalvos

Naudojamas 0,3% karboksino (filtruotas) fuksinas. Šis dažiklis yra pagamintas iš alkoholių: fenolio mišinio etanolyje (90%) arba metanolio (95%), ir šiame mišinyje ištirpinami 3 gramai bazinio fuksino..

Spalvų mažinimo tirpalas

Šiame etape galite naudoti 3% alkoholio rūgšties arba 25% sieros rūgšties tirpalus.

Antrinė spalva (anti-dažiklis)

Dažniausiai dažai, naudojami mėginių kontrastui atlikti, paprastai yra 0,3% metileno mėlynas. Tačiau galima naudoti ir kitus, pvz., 0,5% malachito žalią.

Technika

Rūgštinio dažymo procedūra

Paruoškite bakterinį tepinėlį

Šis preparatas gaminamas ant švaraus ir sauso stiklelio, laikantis atsargumo priemonių.

Tepimo džiovinimas

Tepalą išdžiovinkite kambario temperatūroje.

Šildykite mėginį

Mėginys turi būti šildomas, uždedant žemiau esantį stiklelį. Tvirtinimas su alkoholiu gali būti atliekamas, kai tepinėlis nebuvo paruoštas su skrepliais (apdorotas natrio hipochloritu, kad jį balinti), ir jei jis nebus dažomas nedelsiant..

M. tuberculosis Jis pašalinamas su balikliu ir dažymo proceso metu. Neapdorotų skreplių termofikavimas nebus nužudomas M. tuberculosis, kadangi fiksavimas su alkoholiu yra baktericidinis.

Uždenkite dėmę

Dėmės padengtos karbolio fuksino tirpalu (pirminiu pagrindiniu dažymu).

Šildykite dėmę

Tai daroma 5 minutes. Turėtumėte pastebėti garų išsiskyrimą (apie 60 ° C). Svarbu ne perkaitinti ir išvengti degimo.

Kalbant apie dėmių šildymą, reikia labai atsargiai šildyti fuchsin carbol, ypač jei dažymas atliekamas ant dėklo ar kito konteinerio, kuriame iš ankstesnių dėmių buvo surinkti labai degūs chemikalai..

Naudojant apšviestą tamponą, sudrėkintą keliais lašais rūgščiojo alkoholio, metanolio arba 70% etanolio, po skaidres reikia uždėti tik nedidelę liepsną. Venkite naudoti dideliu etanoliu sudrėkintu tamponu, nes tai yra gaisro pavojus.

Nuplaukite dėmę

Šis plovimas turi būti atliekamas švariu vandeniu. Jei vandentiekio vanduo nėra švarus, tepinį nuplaukite filtruotu arba distiliuotu vandeniu.

Uždenkite tepinėlį rūgštiniu alkoholiu

Šis rūgštis alkoholis turėtų būti 3%. Uždengimas atliekamas 5 minutes arba tol, kol tepalas bus pakankamai spalvotas, ty šviesiai rožinis.

Reikia atsižvelgti į tai, kad rūgštis alkoholis yra degus; todėl jis turi būti naudojamas labai atsargiai. Venkite uždegimo šaltinių.

Nuplaukite dėmę

Skalbimas turi būti atliekamas su švariu, distiliuotu vandeniu.

Uždenkite tepinėlį dažais

Jis gali būti žalias malachitas (0,5%) arba metileno mėlynas (0,3%) dažiklis 1 arba 2 minutes, naudojant ilgiausią laiką, jei tepinėlis yra plonas.

Nuplaukite dėmę

Dar kartą reikia naudoti švarų vandenį (distiliuotas).

Nusausinkite

Stiklelio užpakalinė dalis turi būti išvalyta, o dėmės turi būti dedamos į drenažo lentyną, kad ji būtų išdžiovinta ore (nenaudokite sugeriamojo popieriaus)..

Ištirkite mikroskopo tepinėlį

Turi būti naudojamas 100X tikslas ir panardinimo alyva. Sistemingai nuskaitykite tepinėlį ir užrašykite atitinkamas pastabas.

Interpretuokite rezultatus

Teoriškai mikroorganizmai, kurie yra dažyti raudonai, laikomi teigiamai rūgštimi (AAR +).

Atvirkščiai, jei mikroorganizmai yra dažyti mėlynos arba žalios spalvos, priklausomai nuo dažų, naudojamų kaip priešnuodis, jie laikomi neigiamu alkoholiui atspariu rūgštimi (AAR).

Nuorodos

1. Apurba, S. & Sandhya, B. (2016). Praktinės mikrobiologijos pagrindai (1 red.). Jaypee Brothers medicinos leidėjai.
2. Bauman, R. (2014). Mikrobiologija su ligomis pagal kūno sistemą (4-asis red.). Pearson Education, Inc.
3. Heritage, J., Evans, E. & Killington, A. (1996). Įvadinė mikrobiologija (1 red.). Cambridge University Press.
4. Morello, J., Granato, P. Wilson, M. & Morton, V. (2006). Mikrobiologijos laboratorinis vadovas ir darbo knyga (11-asis red.). „McGraw-Hill“ mokymas.
5. Vasanthakumari, R. (2007). Mikrobiologijos vadovėlis (1 red.). B.I. Publikacijos PVT.