Gramo dėmių pagrindas, medžiagos, technika ir panaudojimas



The Gramo dažai yra paprasčiausias ir naudingiausias dažymo būdas diagnostinėje mikrobiologijoje. Šį metodą sukūrė danų gydytojas Hansas Christianas Gramas 1884 m..

Huckeris 1921 m. Atliko tam tikrus pakeitimus, kad stabilizuotų reagentus ir pagerintų dėmių kokybę, todėl Gramo dažai taip pat žinomi kaip Gram-Hucker.

Šiuo metodu galima stebėti ir mikroorganizmų formą, t. Y. Kokie yra kokosai, bacilai, kokcobacilai, pleomorfiniai, gijiniai. Taip pat jos pasiskirstymas erdvėje: klasteryje, grandinėje, izoliuotas, poromis, tetraduose ir pan..

Jei įtariama bakterinė infekcija, dauguma gautų mėginių turi būti paskleidžiami ant skaidrių ir dažomi gramais, kad būtų galima atlikti tyrimą mikroskopu..

Gramo ataskaita padės gydytojui, kokio tipo mikroorganizmai gali sukelti infekciją, prieš gaunant galutinį pasėlių rezultatą.

Kai kuriais atvejais paciento gyvenimas yra labai pavojingas, todėl gydytojams skubiai reikia Gramo ataskaitos, kad būtų galima atlikti empirinį gydymą, kol laukia mikroorganizmo identifikavimo..

Pavyzdžiui, jei grame atskleidžia, kad smegenų skystyje yra gramteigiamų kokių, gydytojas pradės gydyti antibiotikais, kurie pašalina šios rūšies bakterijas, pagal jam nustatytus protokolus..

Pasibaigus galutiniam rezultatui su izoliuoto mikroorganizmo pavadinimu ir atitinkama antibiotika, gydytojas įvertins, ar pakeisti gydymą. Šis sprendimas bus priimtas atsižvelgiant į mikroorganizmo jautrumo antibiotikams tyrimą ir paciento raidą..

Indeksas

  • 1 Fondas
  • 2 Medžiagos
  • 3 Dažų ir reagentų paruošimas
    • 3.1. Crystal violetinis tirpalas
    • 3.2 Iodo-Lugolis
    • 3.3 Balinimas
    • 3.4 Kontrastas
  • 4 Reagentų laikymas
  • 5 Spalvoto mėginio plitimo paruošimas
    • 5.1. Tiesioginių mėginių gramas
    • 5.2. Augalų gramas
  • 6 Technika
  • 7 Naudingumas
  • 8 Dažniausios klaidos
  • 9 Nuorodos

Fondas

Tai yra metodas, kuriame pateikiami 4 pagrindiniai žingsniai: dažymas, fiksavimas su miglotais, spalvos pasikeitimas ir kontracepcija. Todėl šis metodas, be bakterijų dažymo, taip pat skiriasi.

Kristalas violetinis yra pirmasis naudojamas dažiklis. Jis turi afinitetą peptidoglikanui ir purpurinė spalva užteps visas esamas bakterijas, tada dedamas bagolis, kuris veikia kaip miglotas, tai reiškia, kad jis sukels netirpių kristalinės violetinės jodo - ribonuklidinių baltymų kompleksų susidarymą ląstelėje..

Gram-pozityvios bakterijos, turinčios storą peptidoglikano sieną, sudaro daugiau kompleksų (kristalinės violetinės jodo), todėl jie išlaiko dažus.

Tai taip pat turi įtakos tai, kad gramteigiamos bakterijos siena turi didesnį kiekį nesočiųjų rūgščių, kurios rodo didelį afinitetą oksiduojantiems agentams (Lugol).

Tuo tarpu gramneigiamos bakterijos turi ploną peptidoglikano sluoksnį, dėl kurio bakterijos yra mažiau sudėtingos nei gramteigiamos bakterijos..

Tada atsiranda spalvos pasikeitimo žingsnis, kai gramteigiamos ir gramnegatyvios bakterijos veikia skirtingai.

Gramo neigiamos bakterijos turi išorinę membraną, turinčią daug lipopolisacharidų, kurie yra jo ląstelės sienelės dalis. Riebalai sunaikinami kontaktuojant su alkoholio acetonu, todėl išorinė membrana yra destabilizuota, išlaisvinamas violetinis kristalas.

Tokiu būdu jis yra priešpriešinis su safraninu arba pagrindiniu fuchsinu, atsižvelgiant į raudoną spalvą.

Gram-teigiamų bakterijų atveju jie priešinasi spalvos pasikeitimui, nes baliklis veikia uždarant poras, o tai neleidžia kristalinio violetinio / jodo kompleksui išeiti.

Todėl violetinio kristalo spalva yra stabili, ir nėra vietos safraninui ar fuksinui. Dėl šios priežasties šios bakterijos dažomos intensyviai mėlynos arba violetinės spalvos.

Medžiagos

Gramo spalvų rinkinį sudaro:

  • Violetinis kristalas
  • Lugol
  • Acetonas
  • Safraninas arba bazinis fuchsinas

Dažų ir reagentų paruošimas

Kristalinis violetinis tirpalas

A sprendimas:

Violetinis kristalas -2 gr

Etilo alkoholis 95% -20cc

B sprendimas:

Amonio oksalatas -0,8 g

Distiliuotas vanduo - 80 ml

Galutiniam violetinio kristalo paruošimui 1:10 tirpalas turi būti atskiestas distiliuotu vandeniu ir sumaišomas su 4 dalimis tirpalo B. Prieš naudojimą mišinys laikomas 24 valandas. Jis filtruojamas kolboje gintaro dažymui naudojant popierinį filtrą.

Kasdien naudojamas kiekis perkeliamas į gintaro buteliuką su lašintuvu.

Iodo-Lugolis

Pasverkite ir išmatuokite nurodytą kiekvieno junginio kiekį:

Iodo kristalai - 1gr

Kalio jodidas - 2gr

Distiliuotas vanduo -300 cm3

Kalio jodidas ištirpsta truputį vandenyje ir tada pridedamas jodas. Tirpalas nuskustas į gintaro spalvos butelį.

Kasdien naudojamas kiekis perkeliamas į mažesnį gintaro butelį su lašintuvu.

Balinimas

95% etilo alkoholio -50 ml

Acetonas - 50 ml

Jis paruošiamas lygiomis dalimis. Gerai uždenkite, jis linkęs išgaruoti.

Įdėkite į butelį su lašintuvu.

Šis preparatas suteikia spalvos pakitimą vidutiniškai 5–10 sekundžių ir yra labiausiai rekomenduojamas.

Pradedantiesiems pirmenybė teikiama tik 95% etilo alkoholio naudojimui, kai spalvos pasikeitimas yra lėtesnis nuo 10 iki 30 sek.

Nors labiausiai patyrę asmenys gali naudoti gryną acetoną, kurio spalvos pakitimai labai greitai vyksta nuo 1 iki 5 sek.

Kontrastas

Safranino tirpalas

Safranina -2,5 gr

Etilo alkoholis 95% -100 cm3

Sveriant nurodytą kiekį safranino ištirpsta 100 ml etilo alkoholio iki 95%.

Darbinis safranino tirpalas paruošiamas iš pradinio tirpalo.

Norėdami tai padaryti, išmatuokite 10 cm3 pradinio tirpalo, įpilkite 90 ml distiliuoto vandens, kad būtų užbaigtas 100 ml.

Rekomenduojama kasdien perkelti į gintaro butelį lašintuvu.

Mikroorganizmai, kurie Gram-Hucker dėmėmis, pvz., Tam tikrais anaerobais, silpnai gramuoja neigiamai, Legionella sp, Campylobacter sp ir Brucella sp, jie gali būti žymiai geriau nudažyti, jei naudojamas Kopeloffo padarytas Gram-Hucker dažymas, vadinamas Gram-Kopeloffu,.

Šis metodas pakeičia safranino dažus pagrindiniu fuchsinu. Naudojant šį modifikaciją, galima efektyviai spalvoti minėtus mikroorganizmus.

Reagentų laikymas

Paruošti dažai turi būti laikomi kambario temperatūroje.

Mėginio paruošimas plinta į spalvą

Mėginyje turi būti ne mažiau kaip 10%. \ T5 Mikroorganizmai, prieš stebint mikroorganizmą, yra tikėtini. Paskirstymas gali būti atliekamas iš tiesioginio mėginio arba kultūrų kietose arba skystose terpėse.

Sklaidos priemonės turi būti vienodos, gerai paskirstytos ir ne per storos, kad būtų galima geriau atvaizduoti esamas struktūras.

-Tiesioginių mėginių gramas

Šlapimo gramas be centrifugos

Šlapimas yra sumaišomas ir ant stiklelio dedamas 10 μl. Mažiausiai vienos bakterijos / panardinimo lauko stebėjimas rodo, kad yra infekcija.

Tai reiškia, kad kultūra turi maždaug daugiau kaip 100 000 CFU / ml (10%)5 85% atvejų.

Šis metodas nėra naudingas kolonijų skaičiui, mažesniam nei 100 000 CFU.

LCR gramas

CSF turėtų būti centrifuguojamas, pašalinamas viršutinis sluoksnis ir granulės paskleidžiamos ant skaidrių. Šis skystis normaliomis sąlygomis yra sterilus; bakterijų stebėjimas rodo infekciją.

Kvėpavimo mėginių gramas

Diagnozėje visuomet bus nukreiptas skrepis Gram, bronchų ar bronchoalveolinis skalavimas, nors gali būti įvairių mikroorganizmų, be to, yra naudingas stebimas ląstelių tipas.

Jei yra skreplių, tepinėlis turi būti paruoštas su pačiomis pūlingesnėmis mėginio dalimis.

Stool Gram

Nerekomenduojama atlikti šio tipo mėginiams „Gram“, nes ji neturi diagnostinės vertės.

-Gramo augalai

Jie gali būti atliekami dviem būdais: vienas iš skystų augalų ir kitas iš kietųjų kultūrų.

Skystos kultūros

Iš skystų kultūrų jis yra labai paprastas; po žiebtuvėliu paimami keli drumstos sultinio kepsniai ir jie dedami ant švaraus ir sauso stiklelio, suteikiant apskritimo judesius iš centro į periferiją, kad medžiaga būtų tolygiai paskirstyta.

Leidžiama spontaniškai išdžiūti ore. Išdžius, medžiaga pritvirtinama prie lakšto šilumos. Dėl to, naudojant spaustuką, lapas 3 per keturis kartus per Bunseno degiklio liepsną, neskaitant medžiagos.

Lapui leidžiama atvėsti ir uždėti ant dažymo tilto.

Kietosios kultūros

Jei norite pratęsti „Gram“ spalvą iš kietos kultūros, atlikite šiuos veiksmus:

Prieš pasirenkant reikiamas kolonijas, reikia paruošti stiklelį, įdėjus du lašus maždaug sterilaus fiziologinio tirpalo tirpalo..

Jei pradinėje kultūros plokštelėje yra keletas skirtingų kolonijų tipų, kiekvienai iš jų bus pasirinkta atskira kolonija, kuri atliks gramatiką. Kiekviena kolonija bus paimta su platinos kilpa, kad ją ištirptų druskos tirpale, esančiame anksčiau ant stiklelio.

Apskritieji judesiai nuo centro iki periferijos skiriami kolonijai vienodai paskirstyti ant skaidrių..

Leidžiama spontaniškai išdžiūti ore. Išdžiovinus lapą šiluma, kaip paaiškinta aukščiau (liepsnoja ugnį su žiebtuvėliu), nepamirškite medžiagos.

Ši procedūra turi būti atliekama su kiekviena skirtinga kolonija. Ant popieriaus lapo turi būti pažymėta pastebėta tvarka, pavyzdžiui:

1-oji kolonija: geltona beta-hemolizinė kolonija

2 kolonija: grietinėlės kolonija, be hemolizės: pastebėta gramnegatyvių kokcobacilių.

Kiekvienas lapas turi būti paženklintas, kad žinotų, ką stebime.

Technika

Gramos dažymo technika yra labai paprasta atlikti ir palyginti nebrangi ir negali būti praleista mikrobiologijos laboratorijoje.

Tai daroma taip:

  1. Pritvirtinkite tepinėlį karščiu ir padėkite ant spalvoto tilto.
  2. Lapas yra visiškai padengtas violetiniu stiklu 1 minutę.
  3. Nuplaukite vandeniu. Negalima išdžiūti
  4. Uždenkite plokštelę Lugol tirpalu, palikite 1 minutę. Nuplaukite vandeniu. Negalima išdžiūti.
  5. 5-10 sekundžių sumaišykite, atsargiai maišant acetono alkoholiu. Arba padėkite lakštą vertikalioje padėtyje ir ant paviršiaus lašinkite lašelius, kol likęs violetinis stiklas nuvilktas. Neviršykite.
  6. Nuplaukite vandeniu. Negalima išdžiūti.
  7. Pakeiskite lakštą ant spalvoto tilto ir 30 sekundžių uždenkite safraninu (Gram-Hucker) arba 1 min. Su pagrindiniu fuksinu (Gram-Kopeloff).
  8. Nuplaukite vandeniu
  9. Leiskite spontaniškai išdžiūti vertikaliame ore.

Išdžius 1 lašą panardinamojo alyvos, kad jį stebėtumėte pagal 100X tikslą optiniame mikroskope.

Naudingumas

Šis metodas leidžia atskirti daugumos bakterijų morfotografinius skirtumus.

Mielės taip pat išsiskiria šia spalva. Jie imasi kristalinės violetinės spalvos, tai yra, teigiami Gramo.

Kita vertus, galima išskirti gramteigiamą sporą formuojančią bacilę, kurioje bacilų viduje pastebima aiški erdvė, kur susidarė endosporas, nors sporos netinkamos gerai. Norėdami naudoti sporas, naudojami kiti būdai, tokie kaip Shaeffer-Fulton.

Pažymėtina, kad šis dažymas nesukelia visų rūšių bakterijų spalvos, ty yra atvejų, kai dažymas neveikia.

Šiuo atveju galima paminėti bakterijas, kuriose trūksta ląstelės sienelės. Pavyzdžiui: Mycoplasma gentis, sferoplastai, ureazma, L formos ir protoplastai.

Be to, ji blogai bakterijų, turinčių daug mikolio rūgščių, pvz., Mikobakterijų ir intracelulinių bakterijų, tokių kaip Chlamydias ir Rickettsias.

Taip pat yra neveiksminga daugelio spirocetinių bakterijų dažymas.

Yra tos pačios genties bakterijų, kurios gali būti pastebėtos tame pačiame mėginyje kaip Gramas teigiamas ir kaip Gram neigiamas. Kai taip atsitinka, tai vadinama kintamu Gramo dažikliu, kuris gali būti dėl maistinių medžiagų pokyčių, temperatūros, pH arba elektrolitų koncentracijos..

Dažniausios klaidos

Balinti pernelyg

Pasipiktinimas spalvos pakitimo pakopoje gali sukelti netikrų gram-neigiamų mikroorganizmų stebėjimą.

Negalima laukti, kol įdėsite alyvą, kad džiovinimo laikas būtų pakankamai ilgas:

Ši klaida sukelia riebalinių micelių susidarymą, dėl kurių sunku stebėti esamas struktūras. Taip atsitinka, kai aliejus prisijungia prie tepalo esančių vandens molekulių.

Pakartokite reagentų tvarką:

Tokia klaida sukels gramneigiamas bakterijas, kad jos rodytų violetines, ty klaidingas gramteigiamas.

Naudokite senas kultūras (kietas arba skystas):

Tai gali sukelti gramteigiamas bakterijas dažyti Gram neigiamą (klaidingą Gram neigiamą). Taip atsitinka todėl, kad senosiose kultūrose yra tikėtina, kad yra mirusių ar pablogėjusių bakterijų, ir esant tokioms sąlygoms bakterijos nelieka violetinio kristalo.

Naudokite labai seną Lugol tirpalą:

Laikui bėgant bagažas praranda savo savybes ir spalva išnyks. Jei naudojamas jau degeneruotas reagentas, jis netvirtina krištolo violetinės spalvos, todėl yra galimybė gauti klaidingą mikroorganizmų vizualizaciją..

Melsvas fonas

Tinkamai nudažytas fonas bus raudonas. Mėlynas fonas rodo, kad spalvos nepakankamumas.

Nuorodos

  1. Ryanas KJ, Ray C. 2010. Sherris. Mikrobiologija Medicina, 6-asis leidimas McGraw-Hill, Niujorkas, JAV
  2. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis red.). Argentina, Redakcijos Panamericana S.A..
  3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Argentina Panamericana S.A Redaktorius
  4. Casas-Rincón G. 1994. General Mycology. 2-asis red. Universidad Central de Venezuela, bibliotekos leidiniai. Venesuela, Karakasas.
  5. „Gramas“ Vikipedija, laisva enciklopedija. 4 spalis 2018, 23:40 UTC. 2018 m. Gruodžio 9 d., 17:11. Paimta iš es.wikipedia.org.
  6. González M, González N. 2011. Medicinos mikrobiologijos vadovas. 2-asis leidimas, Venesuela: Karabobo universiteto žiniasklaidos ir leidinių direktoratas.
  7. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S, Cerón-González G, Franco-Cendejas F. Bazinis dažymas mikrobiologijos laboratorijoje. Neįgalumo tyrimai. 2014 m. 3 (1): 10-18.