„Giemsa“ dažymo pagrindas, medžiagos, technika ir panaudojimas



The Giemsa dėmė yra klinikinių mėginių dažymo tipas, pagrįstas rūgščių ir bazinių dažų mišiniu. Jos sukūrimą įkvėpė Romanowsky atliktas darbas, kur Gustav Giemsa, chemikas ir bakteriologas, kilęs iš Vokietijos, jį tobulino, pridėdamas glicerolį, kad stabilizuotų junginius..

Pradiniai Romanowskio technikos pokyčiai leido gerokai pagerinti mikroskopinius stebėjimus, todėl technika buvo pakrikštyta Giemsa dėmės pavadinimu.

Būdamas lengva atlikti, ir aukštas funkcionalumas šiuo metu yra labai ekonomiškai naudojamas klinikinėje laboratorijoje hematologinių tepinėlius, kaulų čiulpų mėginių ir audinių skyriuose.

„Giemsa“ dažymo technika yra labai naudinga citologiniams tyrimams, nes tai leidžia stebėti specifines ląstelių struktūras. Šis metodas sutapo ląstelių citoplazgas, branduolius, branduolius, vakuolus ir granules, kad galėtų atskirti net smulkius chromatino pėdsakus.

Be to, galima nustatyti reikšmingus branduolio dydžio, formos ar spalvos pokyčius, kai galima vizualizuoti branduolio-citoplazmos santykio praradimą.

Kita vertus, jis leidžia nustatyti nesubrendusius kaulų čiulpų ir periferinio kraujo ląsteles, kurios yra svarbios sunkių ligų, tokių kaip leukemija, diagnozei. Taip pat galima nustatyti, be kita ko, hemoparazitus, papildomas ir ląstelių ląsteles, grybus.

Citogenetikoje jis yra gana naudojamas, nes galima tirti ląstelių mitozę.

Indeksas

  • 1 Giemsa spalva
  • 2 Medžiagos
    • 2.1 Medžiagos pagrindinio tirpalo paruošimui
    • 2.2 Motinos tirpalo paruošimo būdas
    • 2.3 Medžiagos buferinio tirpalo paruošimui
    • 2.4 Galutinis dažų paruošimas
    • 2.5 Papildomos medžiagos, reikalingos dažymui atlikti
  • 3 Technika
    • 3.1 Dažymo procesas
  • 4 Komunalinės paslaugos
    • 4.1 Hematologija
    • 4.2 Mikologija
    • 4.3 Bakteriologija
    • 4.4 Parazitologija
    • 4.5 Citologija
    • 4.6 Citogenetika
  • 5 Tyrimas, parodantis Giemsa dažymo efektyvumą
  • 6 Rekomendacijos geram dažymui
  • 7 Dažniausios Giemsa spalvos klaidos
    • 7.1 Labai mėlyna spalva
    • 7.2 Per daug rausvos spalvos
    • 7.3 Kietų nuosėdų buvimas
    • 7.4 Morfologinių artefaktų buvimas
  • 8 Saugojimo režimas
  • 9 Nuorodos

Giemsa spalvos pagrindas

„Romanowsky“ tipo dažikliai grindžiami kontrasto tarp rūgščių ir bazinių dažiklių naudojimu, kad būtų pasiektas bazinių ir rūgščių struktūrų dažymas. Kaip matyti, yra rūgštinių dažų afinitetas dažyti pagrindines struktūras ir atvirkščiai.

Pagrindinis naudojamo dažiklio yra metileno mėlynojo ir jų oksiduotų dariniai (Azuras A ir B Azuras), o rūgštinis dažas eozinas.

Ląstelių rūgštinės struktūros yra, be kita ko, nukleorūgštys, segmentuotų bazofilų granulės, todėl jie bus dažomi metileno mėlynais.

Šia prasme, pagrindiniai struktūros ląstelės yra hemoglobino ir kai granulės, esančius eozinofilų segmentuoti, be kita ko, jie bus dažomi eozinu.

Kita vertus, dėl to, kad metileno mėlynas ir žydras yra būdingas metachromatiniams dažams, jie gali skirtingoms struktūroms suteikti kintamą atspalvį pagal jų turimą polianionų apkrovą..

Taip strateginis pagrindinių ir rūgščių dažų derinys gali sukurti platų spalvų spektrą, atsižvelgiant į kiekvienos struktūros biochemines charakteristikas, vaikščiojant šviesiai mėlynos, tamsiai mėlynos, alyvinės ir raudonos spalvos tonais rūgštinių struktūrų atveju..

Nors eozino suteiktos spalvos yra stabilesnės, spalvos atsiranda tarp rausvai oranžinės ir lašišos.

Medžiagos

Medžiagos pagrindinio tirpalo paruošimui

Ruošiant pradinį tirpalą, reikia sverti 600 mg miltelių pavidalo Giemsa dažiklio, matuojant 500 cc acetono neturinčio metilo alkoholio ir 50 ml neutralaus glicerino..

Motinos tirpalo paruošimo būdas

Sudėkite sunkų „Giemsa“ miltelius į skiedinį. Jei yra gabalėlių, juos reikia purkšti. Vėliau pridėkite pastebimą kiekį išmatuoto glicerino ir gerai sumaišykite. Gautas mišinys pilamas į labai švarų gintaro butelį.

Likusi glicerino dalis dedama į skiedinį. Dar kartą sumaišykite, kad išvalytumėte likusį dažą, kuris buvo pritvirtintas prie skiedinio sienelių, ir supilkite į tą patį butelį.

Butelis dengiamas ir 2 valandas laikomas vandens vonioje 55 ° C temperatūroje. Bain-marie vonioje lengvai maišykite mišinį kas pusvalandį.

Vėliau mišiniui leidžiama atvėsti, kad įdėtų alkoholis. Anksčiau dalis išmatuoto alkoholio buvo patalpinta į skiedinį, kad būtų baigtas plovimas, kas liko iš dažų, ir tada jis pridedamas prie mišinio kartu su likusiu alkoholiu..

Šiam preparatui turėtų būti leista brandinti ne mažiau kaip 2 savaites. Mėnulio tirpalo dalis turi būti filtruojama.

Siekiant išvengti preparato užteršimo, rekomenduojama perduoti dalį, kuri bus nuolat naudojama nedideliam gintaro buteliukui su lašintuvu. Pakartokite kiekvieną kartą, kai baigiasi reagentas.

Medžiagos, skirtos paruošti buferinį tirpalą

Kita vertus, buferinis tirpalas, kurio pH yra 7,2, paruošiamas taip:

Pasveriama 6,77 g bevandenio natrio fosfato (NaHPO)4), 2,59 g kalio dihidrofosfato (KH)2PO4) ir distiliuotą vandenį iki 1000 cm3.

Galutinis dažų paruošimas

Ruošiant galutinį dažo tirpalą yra nustatytas 2 ml tirpalo filtruoto ir sumaišyti su 6 ml buferinio tirpalo. Mišinys maišomas.

Svarbus faktas, į kurį reikia atsižvelgti, yra tai, kad dažų paruošimo metodai gali keistis pagal komercinį namą.

Papildomos medžiagos, reikalingos dažymui atlikti

Be aprašytų medžiagų, ji turėtų būti aprūpinta spalvotais tilteliais, vandens ekranais arba skalbimo buferiu, daiktų ar dangčių lapais, chronometru, skirtu dažų laikui kontroliuoti, ir popieriaus ar kitokios medžiagos džiovinimui ( marlė arba medvilnė).

Technika

Dažymo procesas

1) Prieš dažymą reikia, kad mėginys būtų pasiskirstęs ant švarios skaidrės..

Mėginiai gali būti kraujas, kaulų čiulpai, histologinių audinių gabalai arba gimdos kaklelio makšties mėginiai. Rekomenduojama, kad išorinės medžiagos būtų plonos ir prieš dažymą jas išdžiovintų po 1 ar 2 valandas.

2) Visi lapai, kuriuos reikia nuspalvinti, dedami ant spalvoto tilto. Visada dirbkite ta pačia tvarka ir gerai nustatykite kiekvieną lapą.

3) Užpilkite keletą lašų 100% metilo alkoholio (metanolio) ant tepinėlės ir palikite 3–5 minutes, kad būtų galima nustatyti ir dehidratuoti mėginį..

4) Metanolį, esantį lape, išmeskite ir išdžiovinkite.

5) išdžiovinus, galutinį dažymo tirpalą įpilkite lašintuvu, kol bus padengtas visas lakštas. Palikite 15 minučių. Kai kurie autoriai rekomenduoja iki 25 min. Priklauso nuo komercinio namo.

6) Nusausinkite dažus ir nuplaukite tepalu distiliuotu vandeniu arba 7,2 buferiniu tirpalu.

7) Blotiniame popieriuje lapai išdžiovinami atvirame ore, vertikaliai, padedant atramai.

8) Nuvalykite slydimo nugarėlę marlu arba medvilniniu tamponu, sudrėkintu alkoholiu, kad pašalintumėte likusius dažus.

Komunalinės paslaugos

Giemsa dažymo technika naudojama keliose srityse, įskaitant: hematologiją, mikologiją, bakteriologiją, parazitologiją, citologiją ir citogenetiką.

Hematologija

Tai dažniausia šio dažymo priemonė. Su juo mes galime nustatyti kiekvieną iš ląstelių, esančių kaulų čiulpų arba periferinio kraujo mėginiuose. Įvertinus kiekvienos serijos skaičių, galima aptikti leukocitozę, leukopeniją, trombocitopeniją ir kt..

Kadangi ji yra jautri, kad būtų galima nustatyti nesubrendusias ląsteles, jis yra svarbus diagnozuojant ūmines ar lėtines leukemijas. Taip pat galima diagnozuoti ir anemiją, pavyzdžiui, pjautuvo ląstelių ligą, pjautuvo ląstelių ligą..

Mikologija

Šioje srityje yra įprasta naudoti jį ieškoti Histoplasma capsulatum (intracelulinis dimorfinis grybelis) audinių mėginiuose.

Bakteriologija

Hematologiniais tepinėliais, dažomais Giemsa, galima aptikti Borrelias sp pacientams, kuriems liga vadinama karščiavimu. Spirocetai gausu tarp eritrocitų, mėginiuose, paimtuose nuo karščiavimo.

Taip pat galima vizualizuoti intracelulines bakterijas Rickettsias sp ir Chlamydia trachomatis užkrėstose ląstelėse.

Parazitologija

Parazitologijos srityje Giemsa dažymas leido diagnozuoti parazitines ligas, tokias kaip maliarija, Chago liga ir leishmaniazė..

Per pirmuosius du parazitus Plasmodium sp ir Trypanosoma cruzi atitinkamai jie gali būti vizualizuoti infekuotų pacientų periferiniame kraujyje, jie gali būti skirtingais etapais pagal ligos fazę..

Siekiant pagerinti kraujo parazitų paiešką, rekomenduojama naudoti Giemsa dėmę, sumaišytą su May-Grünwald dažais.

Be to, odos leišmaniozė gali būti diagnozuojama įvertinant mėginius odos biopsijų tamsintas su Giemsa kur parazitas yra.

Citologija

Giemsa dažymas taip pat naudojamas endocervikinių mėginių citologiniam tyrimui, nors tai nėra dažniausiai naudojamas šiam tikslui metodas..

Tačiau tais atvejais, kai ribotų išteklių jis gali būti naudojamas, turintys funkcionalumą panašų į kurią teikia Papanicolou techniką ir už mažesnę kainą. Tačiau tam reikalinga eksperto patirtis.

Citogenetika

Svarbus „Giemsa“ dažymo bruožas yra jo gebėjimas stipriai prisijungti prie DNR adeninų ir timinų turinčių regionų. Tai leidžia DNR vizualizuoti ląstelių mitozės metu, skirtingose ​​kondensacijos būsenose.

Šie tyrimai yra būtini norint nustatyti chromatines aberacijas, pvz., Skirtingų chromosomų regionų dubliavimą, ištrynimą ar perkėlimą..

Tyrimas, rodantis Giemsa dažymo efektyvumą

Cannova ir kt. (2016) palygino 3 dažymo būdus odos leishmaniozės diagnozei.

Tam jie naudojo mėginius, gautus iš eksperimentinio gyvūno (Mesocrisetus auratus) eksperimentiškai inokuliuojama su Leishmanias.

Autoriai parodė, kad Giemsa dažymas buvo geresnis nei Pap-mart® ir Gaffney dažymas. Todėl jie manė, kad „Giemsa“ dažai idealiai tinka diagnozuoti odos leishmaniją.

Puikūs autorių gauti rezultatai yra susiję su tuo, kad dažų, sudarančių „Giemsa“ mišinį, derinys sudaro būtinas sąlygas, kad būtų sukurtas palankus kontrastas, leidžiantis aiškiai atskirti amastigotines struktūras, tiek vidaus, tiek ekstraląsteliniu būdu..

Kiti metodai („Pap-mart®“ ir „Gaffney“) taip pat tai padarė, tačiau silpnesniu būdu, todėl buvo sunkiau vizualizuoti. Štai kodėl „Giemsa“ dėmių rekomenduojama leismaniozės diagnozei.

Be to, Ramírez ir kt. Tyrimas (1994) įvertino Giemsa ir Lendrum dėmių galiojimą konjunktyviniuose tepaluose, siekiant nustatyti Chlamydia trachomatis.

Autoriai nustatė, kad Giemsa ir Ledrum dažymas turi tą patį specifiškumą, tačiau Giemsa buvo jautresnė.

Tai paaiškina, kodėl šiuo metu „Giemsa“ dažymas yra dažniausiai naudojamas chlamidinių infekcijų diagnozei, ypač jei yra mažai išteklių.

Rekomendacijos geram dažymui

Lakštų džiovinimas neturėtų būti pagreitintas. Privalomasis laikas turi būti laukiamas, kol išdžiūsta lauke. Maždaug 2 valandos.

Spalvą tuoj pat po 2 valandų, kad pasiektumėte geriausius rezultatus.

Kad tepinėliai būtų tvirtesni ir dažyti geriau, mėginys turi būti paskirstytas ant lapo taip, kad liktų plonas ir vienodas sluoksnis..

Pageidautinas kraujo mėginys yra kapiliaras, nes tepinėlis yra pagamintas tiesiai iš kraujo lašelio, todėl mėginys neturi priedų, kurie skatina ląstelių struktūrų palaikymą..

Tačiau, jei naudojamas veninis kraujas, EDTA reikia vartoti kaip antikoaguliantą, o ne hepariną, nes pastarieji paprastai deformuoja ląsteles.

Dažniausios Giemsa spalvos klaidos

Šios spalvos praktikoje galima padaryti klaidų. Juos įrodo staigūs struktūrų atspalvių pokyčiai.

Ypač mėlyna spalva

Tai gali būti dėl:

  • Labai stori tepinėliai
  • Viršijus dažymo laiką
  • Per mažai skalbimo.
  • Reagentų naudojimas gerokai viršija neutralų pH (šarminis).

Esant tokioms sąlygoms, iškraipomos šių struktūrų spalvos, todėl eritrocitai, užuot mirę rožinės spalvos lašišą, atrodys žalūs, eozinofilų granulės, kurios turėtų būti dažytos raudona plyta, taps mėlynos arba pilkos spalvos ir tt nukrypimas nuo įprastų tonų.

Per daug rožinė spalva

Tai gali būti dėl:

  • Nepakankamas dažymo laikas.
  • Ilgalaikis arba per didelis plovimas.
  • Netinkamas džiovinimas.
  • Labai rūgščių reagentų naudojimas.

Šiuo konkrečiu atveju struktūros, kurios paprastai yra mėlynos spalvos, nebus beveik matomos, o spalvos rožinės struktūros turės labai perdėtus tonusus.

Pavyzdys: eritrocitai bus ryškiai raudonos arba stiprios oranžinės spalvos, branduolinis chromatinas atrodys šviesiai rožinis, o eozinofilų granulės taps ryškiai raudonos..

Kietų nuosėdų buvimas

Priežastys gali būti:

  • Naudokite purvinus arba prastai plaunamus lapus.
  • Neleiskite tepiniui gerai išdžiūti.
  • Palikite tvirtinimo tirpalą per ilgai.
  • Netinkamas plovimas dažymo pabaigoje.
  • Netinkamas naudojamo dažiklio filtravimas arba nefiltravimas.

Morfologinių artefaktų buvimas

Piktžolėse gali atsirasti morfologinių artefaktų, todėl sunku vizualizuoti ir interpretuoti esamas struktūras. Taip yra dėl:

  • Naudojamas antikoaguliantų tipas, pvz., Heparinas.
  • Nešvarių, pažeistų ar riebių lapų naudojimas.

Saugojimo režimas

Po paruošimo dažai turi būti laikomi kambario temperatūroje (15–25 ° C), kad dažai nesusidarytų. Jis turi būti laikomas uždarame gintaro inde.

Nuorodos

  1. Cannova D, Brito E ir Simons M. Spalvos metodų įvertinimas odos leishmaniozės diagnozei. Salus.  2016 m. 20 (2): 24-29.
  2. PanReac Applichem ITW reagentai. Giemsa dėmė. 2 versija: JMBJUL17 CEIVD10ES. Castellar del Vallés, Ispanija.
  3. Clark G. Staining (1981), 4thed. Williams & Willkins.
  4. Taikomoji klinikinė chemija Giemsa dažai diagnozuoti in vitro. Platintojas: cromakit.es
  5. Ramírez I, Mejía M, García de la Riva J, Hermes F ir Grazioso C. Giemsa ir Lendrum dėmių galiojimas konjunktyviniais tepinėliais, siekiant nustatyti Chlamydia trachomatis. Bol iš Sanit Panam. 1994 m. 116 (3): 212-216.
  6. Casas-Rincon G. Bendroji mikologija. 1994. 2-asis Ed. Universidad Central de Venezuela, bibliotekos leidiniai. Venesuela, Karakasas.
  7. "Giemsa dėmė." Vikipedija, laisva enciklopedija. 2017 m. Rugsėjo 1 d., 01:02 UTC. 2018 m. Gruodžio 6 d., En.wikipedia.org.