Spore dažymo pagrindas, metodai ir naudojimo būdai

The sporų dažymas yra metodika, naudojama atspindinti atsparumo struktūras, kurios sudaro kai kurias bakterines gentis, kai jos yra nepalankiomis sąlygomis; šios struktūros atitinka išlikimo būdą.

Yra daug genų, sudarančių sporas; tačiau pagrindiniai yra Bacillus ir Clostridium. Šios gentys laikomos svarbesnėmis, nes joms žmonėms yra patogeninių rūšių.

Kiekvienas bacilis gali sukelti sporas. Tuo metu, kai preparatas dažomas, sporas gali būti randamas bacillus (endospore) arba už jo ribų (exospore). Su įprastomis bakterijų dažymo priemonėmis, pvz., Gramo dažais, sporos lieka bespalvės.

Šiuo metu yra keletas spalvinimo metodikų, galinčių perpjauti storą sporų struktūrą, kad ją būtų galima dažyti. Šios metodikos yra labai įvairios; tarp jų mes galime paminėti Dorner techniką, Möeller dėmę ir Shaeffer-Fulton metodiką, taip pat žinomą kaip Wirtz-Conklin..

Iš visų minėtų metodų „Shaeffer-Fulton“ metodika yra dažniausiai naudojama įprastinėse laboratorijose. Jis pavadintas dviem mikrobiologais, kurie 1930 m. Sukūrė spalvą: Alicia Shaeffer ir MacDonald Fulton. Tačiau kartais ši technika vadinama „Wirtz-Conklin“ dviem 1900-ųjų bakteriologams.

Indeksas

• 1 Fondas
• 2 Sporų dažymo būdai
  • 2.1 Dornerio technika
  • 2.2 Modifikuotas Dornerio metodas
  • 2.3 Shaeffer-Fulton arba Wirtz-Conklin technika
  • 2.4 Möeller technika
  • 2.5 Modifikuota Möeller technika be šilumos
• 3 Naudojimas
  • 3.1 Pavyzdžiai
• 4 Nuorodos

Fondas

Sporos nėra dažomos įprastomis spalvomis, nes jos turi labai storą sieną. Sudėtinga sporų sudėtis neleidžia patekti į daugelį dažiklių.

Jei sporos tiriamos iš išorės į vidų, stebimi šie sluoksniai: pirma, exosporium, kuris yra ploniausias išorinis sluoksnis, kurį sudaro glikoproteinai..

Tada ateina odelė, kuri užtikrina atsparumą aukštai temperatūrai, o po to - žievė, sudaryta iš peptidoglikano. Tada yra pagrindo sienelė, kuri apsaugo protoplastą.

Spora yra dehidratuota struktūra, kurioje yra 15% kalcio ir dipikolino rūgšties. Todėl dauguma sporų dažymo būdų grindžiami šilumos panaudojimu, kad dažai galėtų prasiskverbti į storą struktūrą.

Kai sporos yra dažytos, ji negali pašalinti dažų. „Shaeffer-Fulton“ technikoje malachitų žalia įeina į vegetatyvines ląsteles ir, įterpiant šilumą, prasiskverbia į endosporą ir taip pat ir exospores.

Plaunant vandeniu dažai pašalinami iš vegetatyvinės ląstelės. Taip atsitinka todėl, kad žalias malachito dažiklis yra šiek tiek paprastas, todėl jis silpnai susiejasi su vegetatyvine ląstele.

Kita vertus, jis negali išeiti iš sporų ir pagaliau kontrastuoja bacilą su safraninu. Šis pamatas galioja likusiems metodams, kuriuose vyksta kažkas panašaus.

Sporų dažymo būdai

Kad sporos taptų dėmės, turite turėti gryną įtariamo kamieno kultūrą, kurią norite mokytis.

Kultūra 24 valandoms patiria ekstremalią temperatūrą, kad stimuluotų mikroorganizmą sporuliuoti. Dėl šios priežasties kultūra gali būti dedama į orkaitę 44 ° C temperatūroje arba šaldytuve (8 ° C) 24 ar 48 valandas.

Jei minėtose temperatūrose paliekama per daug laiko, bus stebimos tik exosporos, nes visi endosporai bus palikę bacilą.

Pasibaigus laikui, ant švaraus stiklelio turi būti užpilama keletas lašų sterilaus fiziologinio tirpalo. Tada paimama nedidelė dalis pasėlių ir atliekamas smulkus pasiskirstymas. 

Po to jis paliekamas išdžiūti, jis pritvirtinamas prie šilumos ir dažomas kai kuriais toliau aprašytais būdais:

Dornerio technika

1 - Paruoškite į mėgintuvėlį koncentruotą sporuliuoto mikroorganizmo suspensiją distiliuotame vandenyje ir įpilkite vienodo tūrio filtruoto Kinyoun fenolio fuksino..

2 - Įdėkite mėgintuvėlį į vonią su verdančiu vandeniu 5–10 minučių.

3- Ant švaraus stiklelio sumaišykite ankstesnės suspensijos lašą su 10% nigrosino vandeninio tirpalo lašeliu, virintu ir filtruotu.

4 - pratęskite ir greitai išdžiovinkite švelniu karščiu.

5- Išnagrinėti 100X tikslą (panardinimas).

Sporos dėmės raudonos ir bakterinės ląstelės atrodo beveik bespalvės prieš tamsiai pilkos spalvos foną.

Modifikuotas Dornerio metodas

1- Sporuliuotų mikroorganizmų suspensija plinta ant stiklelio ir pritvirtinama prie šilumos.

2- Mėginys yra padengtas filtravimo popieriaus juostele, į kurią pridėta fenilo rūgšties fuchsin. Dažai 5–7 minutes kaitinami Bunsen degiklio liepsna, kol susidaro garų išsiskyrimas. Tada popierius pašalinamas.

3 - Nuplaukite preparatą vandeniu ir išdžiovinkite absorbuojančiu popieriumi.

4. Uždenkite tepinėlį plona 10% nigrosino plėvele, naudodami antrą stiklelį, skirtą nigrosinui ar adata..

Sporų ir bakterijų spalva yra tokia pati, kaip aprašyta ankstesnėje.

Shaeffer-Fulton arba Wirtz-Conklin technika

1) Padarykite ploną pluoštą su sporuliuoto mikroorganizmo suspensija ant stiklelio ir pritvirtinkite jį prie šilumos.

2. Uždenkite stiklelį vandeniniu 5% malachito žaliuoju tirpalu (ant lapo gali būti dedamas filtrinis popierius).

3) Bunseno degiklio liepsną kaitinkite, kad garai išvengtų ir pašalintų liepsną. Pakartokite operaciją nuo 6 iki 10 minučių. Jei procedūros metu malachito žaliasis tirpalas išgaruoja per daug, galima pridėti daugiau.

4- Išimkite filtravimo popierių (jei jis buvo įdėtas) ir nuplaukite vandeniu.

5- 30 sekundžių uždenkite skaidrę 0,5% safranino vandeniu (kai kurie technikos variantai naudoja 0,1% vandeninio safranino ir palieka 3 minutes).

Šiuo būdu sporos yra žalios ir bacilės yra raudonos.

Jo trūkumas yra tas, kad jaunų kultūrų endosporai netinkami gerai, nes jie atrodo labai skaidrūs arba bespalviai. Siekiant to išvengti, rekomenduojama naudoti 48 valandų inkubacijos kultūras.

Möeller technika

1- 2 minutes uždenkite kloroformu.

2 - Išmeskite chloroformą.

3 - 5 minutes uždenkite 5% chromo rūgštimi.

4- Nuplaukite distiliuotu vandeniu

5- Lapas padengtas fuchsin-fenolio karpiu ir veikiamas Bunseno degiklio liepsna iki garų išsiskyrimo; tada ji ištrinama iš liepsnos kelias akimirkas. Operacija kartojama, kol pasiekia 10 minučių.

6- Nuplaukite vandeniu.

7 - Naudokite rūgštintą etanolį (druskos alkoholį), kad išnyktų. Jis paliekamas 20 arba 30 sekundžių.

8 - Nuplaukite distiliuotu vandeniu.

9 - Atsparus dengiamam sluoksniui dengiant metileno mėlyną 5 minutes.

10 - Nuplaukite distiliuotu vandeniu.

11- Jis paliekamas išdžiūti ir mėginys imamas mikroskopu.

Spalvos atrodo raudonos ir mėlynos spalvos. Svarbu ne įkvėpti garų, nes jie yra toksiški ir ilgainiui gali būti kancerogeniniai.

Modifikuota Möeller technika be šilumos

2007 m. Hayama ir jo bendradarbiai sukūrė „Möeller“ technikos modifikaciją. Jie pašalino dažų kaitinimo pakopą ir pakeitė 2 lašus Tergitol 7 paviršinio aktyvumo medžiagos kas 10 ml fuchsin-fenolio karbolio tirpalo. Gauti tie patys rezultatai.

Naudojimas

Sporų spalva suteikia labai vertingą ir naudingą informaciją patogeno identifikavimui, nes tos pačios, jos formos, vietos baciloje ir gebėjimas deformuoti vegetatyvinę ląstelę yra duomenys, galintys padėti rūšiai dalyvauja tam tikroje lyčių lygyje.

Šiame kontekste verta paminėti, kad sporos gali būti apvalios arba ovalios, jos gali būti centre arba paracentrinėje, subtermininėje arba terminalinėje padėtyje..

Pavyzdžiai

- Clostridium difficile formuoja ovalią sporą galinėje padėtyje, kuri deformuoja bacilą.

- Sporos Clostridium tertium Jis yra ovalus, deformuoja bacilą ir yra terminalo lygyje.

- Endosporas Clostridium tetani ji yra terminalinė ir deformuoja bacilą, suteikdama būgnelio išvaizdą.

- Sporos Clostridium botulinum, C. histolyticum, C. novy ir C. septicum jie yra apvalūs arba subterminai ovalo formos ir deformuoja bacilą.

- Endosporas Clostridium sordelli jis yra centrinėje padėtyje, šiek tiek deformavęs.

Nuorodos

1. Hayama M, Oana K, Kozakai T, Umeda S, Fujimoto J, Ota H, Kawakami Y. Pasiūlymas dėl supaprastinto bakterijų sporų dažymo metodo netaikant šiluminio sėkmingo Moellerio metodo modifikavimo. Eur J Med Res. 2007; 16 12 (8): 356-9.
2. Vikipedijos kūrėjai. Moelleris dėmė. Vikipedija, „Laisvas enciklopedija“. 2018 m. Lapkričio 3 d., 03:28 UTC. Galima rasti adresu: en.wikipedia.org
3. Pérez R, Juárez M, Rodríguez (2011). Mikrobiologinių metodų vadovas. Pagrindinių mokslų katedra Mikrobiologijos akademija. Nacionalinis politechnikos institutas.
4. "Endospora". Vikipedija, laisva enciklopedija. 25 Vas 2018, 10:20 UTC. 2019 m. Sausio 10 d., 02:42: en.wikipedia.org
5. Silva L, Silva C, Fernández N, Bueno C, Torres J, Rico M, Macías J ir bendradarbiai. (2006). Ekstremadūros autonominio regiono darbo personalas. Specialioji darbotvarkė IV tomas. Redakcinis MAD. Sevilija – Ispanija, p. 211-212.
6. Silva M, García M, Corrales J, Ponce E. (2006), Galicijos sveikatos tarnybos (SERGAS) specialistų laboratorijos technikas. Dalyko apimtis 2. Redakcinis MAD. Sevilija – Ispanija, p. 79-80.
7. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis red.). Argentina, Redakcijos Panamericana S.A..
8. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. 2009. Bailey & Scott mikrobiologinė diagnozė. 12 red. Argentina Panamericana S.A Redaktorius