Agaro kraujo pamatai, panaudojimas ir paruošimas

The kraujo agaras tai yra praturtinta kieta terpė, diferencinė, bet ne selektyvi. Jis naudojamas daugelio mikroorganizmų regeneravimui ir augimui iš klinikinių mėginių arba subkultūrų.

Reikia įtraukti klasikinį kraujo agarą, kad būtų galima sėti daugumą laboratorijoje gautų klinikinių mėginių; išskyrus išmatose esančius mėginius, jei jie nėra naudingi, nebent būtų paruošti tam tikri pakeitimai.

Ši auginimo terpė iš esmės susideda iš praturtinto bazinio agaro ir 5% kraujo. Agaro pagrindas gali skirtis priklausomai nuo poreikių, tačiau daugiausia bus sudarytas iš peptonų, aminorūgščių, vitaminų, mėsos ekstrakto, natrio chlorido, agaro..

Kalbant apie kraują, paprastai reikia turėti sąlyčio su bioteriumu, kad gautų kraują iš gyvūnų, pavyzdžiui, avių, triušių ar arklių. Tačiau tai ne visada įmanoma ir kartais naudojamas žmogaus kraujas.

Kraujo agaro terpė gali būti ruošiama laboratorijoje arba gali būti įsigyta paruoštai įmonei. Šios terpės paruošimas yra vienas subtiliausių, bet bet koks jo paruošimo nerūpestingumas sukels užterštą partiją.

Štai kodėl reikia imtis visų galimų atsargumo priemonių, o galiausiai kokybės kontrolė turėtų būti atliekama inkubuojant 37 ° C temperatūroje po 1 plokštelę kas 100 paruoštų.

Indeksas

• 1 Fondas
• 2 Naudojimas
  • 2.1 Kraujo grupės pasirinkimas
  • 2.2 Bazinio agaro tipo pasirinkimas
  • 2.3 Kraujo agaro panaudojimas pagal pagrindą, naudojamą jo paruošimui
• 3 Paruošimas
  • 3.1 Pasverkite ir ištirpinkite
  • 3.2 Sterilizuoti
  • 3.3 Kraujo agregacija
  • 3.4 Supilkite į Petri lėkšteles
• 4 Nuorodos

Fondas

Jau minėta, kad kraujo agarui būdinga praturtinta, diferencinė ir neselektyvi terpė. Kiekvieno iš šių savybių pamatas paaiškinamas toliau.

Kraujo agaras yra praturtinta terpė, nes jos pagrindinė priedo medžiaga yra 5-10% kraujo ant agaro bazės. Abiejuose junginiuose yra daug maistinių medžiagų ir ši savybė leidžia daugelyje auginamų bakterijų augti.

Šis augimas vyksta be apribojimų; dėl šios priežasties ji nėra atrankinė. Tačiau, jei prie šios terpės pridedami junginiai, kurie užkerta kelią kai kurių mikroorganizmų augimui ir skatina kitų augimą, jis tampa selektyvus. Taip yra tuo atveju, jei pridedami tam tikri antibiotikų arba priešgrybelinių preparatų tipai.

Lygiai taip pat, kraujo agaras yra diferencinė terpė, nes ji leidžia išskirti 3 tipų bakterijas: beta hemolizinį, alfa-hemolizinį ir gama hemolizinį..

Beta-hemolizikai yra tie, kurie sugeba lizuoti arba visiškai sulaužyti raudonuosius kraujo kūnelius, formuodami aiškią halogeną aplink kolonijas, tokiu būdu gamindami ß arba β hemolizę - hemolizę ir mikroorganizmus vadina ß-hemoliziniu..

Β-hemolizinių bakterijų pavyzdžiai Streptococcus pyogenes ir Streptococcus agalactiae.

Alfa-hemolizikai yra tie, kurie atlieka dalinę hemolizę, kai hemoglobinas oksiduojamas į metemoglobiną, o aplink kolonijas atsiranda žalsva spalva. Šis reiškinys yra žinomas kaip hemolizė α arba α-hemolizė, o bakterijos klasifikuojamos kaip α-hemolizinė.

Α-hemolizinių bakterijų pavyzdys Streptococcus pneumoniae ir Streptococcus grupės viridanai.

Galiausiai yra bakterijų, vadinamų gama-hemoliziniu arba ne hemoliziniu. Jie auga ant agaro, nesukeliant jo pokyčių, o tai žinoma kaip γ-hemolizė, o mikroorganizmai yra γ-hemoliziniai.

Γ-hemolizinių bakterijų pavyzdys: kai kurie D grupės Streptococcus padermės (Streptococcus bovis ir Enterococcus faecalis).

Naudojimas

Kraujo agaro auginimo terpė yra viena iš dažniausiai naudojamų mikrobiologijos laboratorijoje.

Tarp mikroorganizmų, galinčių augti ant kraujo agaro terpės, yra: griežti, fakultatyvūs, mikroaerofiliniai, anaerobiniai, gramteigiami arba gram-neigiami aerobiniai bakterijos, greitai augančios arba lėtai augančios bakterijos..

Taip pat auga kai kurios bakterijos, kurios yra reikalingos arba apsunkina mitybos požiūriu, taip pat grybai ir mielės. Taip pat naudinga subkultūruoti arba pakartotinai suaktyvinti padermes, kurios yra labai silpnai metabolizuojamos.

Tačiau kraujo grupės ir bazinio agaro pasirinkimas skirsis priklausomai nuo tikėtino mikroorganizmo, kuris yra įtariamas regeneravimu, ir plokštelės (kultūros arba antibiotikų) panaudojimą..

Kraujo grupės pasirinkimas

Kraujas gali būti ėriukas, triušis, arklys ar žmogus.

Labiausiai rekomenduojama yra ėriukų kraujas, išskyrus kai kurias išimtis. Pavyzdžiui, norint izoliuoti Haemophilus rūšis, kur rekomenduojamas kraujas yra arklys ar triušis, nes ėriuko kraujyje yra fermentų, kurie slopina faktorių V.

Mažiausiai rekomenduojama yra žmogus, tačiau jis yra labiausiai naudojamas, galbūt todėl, kad jis yra lengviausias. 

Kraujas turi būti defibrinuojamas, gautas be jokių priedų ir sveikų gyvūnų. Norint naudoti žmogaus kraują, reikia atsižvelgti į keletą veiksnių:

Jei kraujas patenka iš asmenų, patyrusių bakterinių infekcijų, jie turės specifinių antikūnų. Esant tokioms sąlygoms, tikėtina, kad kai kurių bakterijų augimas bus slopinamas.

Jei jis yra gaunamas iš kraujo banko, jis turi citrato ir yra tikėtina, kad tam tikros bakterijos nesusidaro. Kita vertus, jei kraujas gaunamas iš antibiotikų vartojančių pacientų, jautrių bakterijų augimą galima slopinti..

Ir jei kraujas yra iš diabetinio asmens, gliukozės perteklius trukdo tinkamai vystytis hemolizei.

Bazinio agaro tipo pasirinkimas

Bazinis agaras, naudojamas kraujo agaro gamybai, gali būti labai platus. Tarp jų yra: maistinės medžiagos agaras, smegenų širdies infuzijos agaras, triptazės sojos agaras, Müeller Hinton agaras, Thayer Martin agaras, Kolumbijos agaras, Brucella agaras, Campylobacter agar ir kt..

Kraujo agaro panaudojimas pagal pagrindą, naudojamą jo paruošimui

Maisto medžiagų agaras

Ši bazė yra mažiausiai naudojama, nes joje augs daugiausia nereikalingos bakterijos, pvz., Enterinės bakterijos, Pseudomonas sp, S. aureus, Bacillus sp, be kita ko. Streptococcus izoliuoti nerekomenduojama.

Širdies smegenų infuzijos agaras (BHI)

Jis yra vienas iš labiausiai naudojamų kaip kraujo agaro pagrindas, nes jis turi reikiamų maistinių medžiagų daugelio bakterijų augimui, įskaitant Streptococcus sp bakterijos. Nors nėra tinkama stebėti hemolizės modelius.

Paprastai su šia baze paprastai naudojamas ėriukų kraujas.

Taip pat gali būti paruošti kraujo agaro variantai, į kuriuos pridedami kiti junginiai tam tikrų mikroorganizmų išskyrimui. Pavyzdžiui, smegenų širdies infuzijos agaras, papildytas triušio krauju, cistinu ir gliukoze, padeda išskirti Francisella tularensis.

Kadangi cistino telluritas yra naudingas izoliacijai Corynebacterium diphteriae. Galite naudoti žmogaus ar ėrienos kraują.

Pirmą kartą beta-hemolizė atrodys kaip siauras halo, o antrasis - daug platesnis.

Be to, ši bazė kartu su bacitracinu, kukurūzų krakmolu, arklių krauju ir kitais praturtinimo priedais (IsoVitaleX) yra naudojama genties izoliavimui. Haemophilus sp kvėpavimo mėginių.

Be to, jei jūs pridedate antibiotikų chloramfenikolio - gentamicino arba penicilino - streptomicino derinį su arklių krauju, jis idealiai tinka reikalaujantiems patogeniniams grybams išskirti, net ir su didesniu nei Sabouraud gliukozės agaru. Tai ypač naudinga izoliuojant Histoplasma capsulatum.

Tryptyvus sojos pupelės

Ši bazė yra labiausiai rekomenduojama geresniam hemolizės modelio ir diagnostinių testų, tokių kaip optoquine ir bacitracin taksonai, stebėjimui. Tai klasikinis kraujo agaras, naudojamas įprastai.

Su šia baze taip pat galite paruošti specialų kraujo agarą Corynebacterium diphteriae, su tellūrinio cistinu ir ėriukų kraujas.

Taip pat šio agaro derinys su ėrienos krauju ir kanamicino-vankomicinu idealiai tinka anaerobų augimui, ypač Bacteroides sp.

Agar Müeller Hinton

Ši bazė, papildyta krauju, yra naudojama reikiamų mikroorganizmų, pvz Streptococcus sp.

Jis taip pat naudingas bakterijų, pavyzdžiui, izoliacijai Legionella pneumophila.

Agar Thayer Martin

Ši terpė yra idealus kraujo agaro pagrindas, kai įtariamas Neisseria gentis, ypač Neisseria meningitidis, nuo to laiko N. gonorrhoeae nesauga ant kraujo agaro.

Jis taip pat skirtas jautrumo testams atlikti Neisseria meningitidis.

Agar Columbia

Ši bazė puikiai tinka skrandžio biopsijų mėginiams sėti Helicobacter pylori.

Terpė paruošiama pridedant 7% ėrienos kraujo, defibrinuojamo antibiotikais (vankomicinu, trimetoprimu, amfotericinu B ir cefsulodinu), siekiant apriboti kitų tipų bakterijų augimą..

Tą pačią bazę, papildytą žmogaus ar ėrienos krauju, nalidikso rūgštimi ir kolistinu, galima naudoti išskiriant Gardnerella vaginalis. Jis taip pat idealiai tinka vertinant antimikrobinį jautrumą to paties mikroorganizmo antibiotikams.

Be to, jis naudojamas kraujo agaro gamybai anaerobams auginti, pridedant aminoglikozidų ir vankomicino..

Ši bazė leidžia mums tinkamai stebėti hemolizės modelius.

„Brucella Agar“

Ši terpė, naudojama kaip kraujo agaro pagrindas, pridėjus vitamino K yra ideali anaerobinių bakterijų auginimui. Šiuo atveju rekomenduojama naudoti ėriukų kraują.

Campylobacter agar

Campylobacter Agar, papildytas 5% avių ir 5 antibiotikais (cefalotinu, amfotericinu B, trimetoprimu, B polimiksinu ir vankomicinu), yra terpė, naudojama izoliuoti Campylobacter jejuni išmatose.

Paruošimas

Kiekvienas komercinis namas atneša pakuotės gale instrukcijas, kaip paruošti litrą kultūros terpės. Atitinkamus skaičiavimus galima atlikti norimam kiekiui paruošti pagal pasirinktą bazinį agarą.

Pasverkite ir ištirpinkite

Bazinis agaras yra dehidratuotas (milteliai), todėl jis turi būti ištirpintas distiliuotame vandenyje, sureguliuotame iki pH 7,3.

Pasirinktame baziniame agare nurodytas kiekis pasveriamas ir ištirpinamas atitinkamame vandens kiekyje fiola, po to pašildomas iki vidutinio karščio ir sumaišomas su sukamaisiais judesiais, kol visas milteliai ištirps..

Sterilizuokite

Ištirpinus, sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 20 minučių.

Kraujo kiekis

Palikdami autoklave, leiskite fiolai atvėsti, kol temperatūra svyruoja nuo 40 iki 50 ° C; yra temperatūra, kurią palaiko žmogaus oda, ir tuo pačiu metu agaras dar nesudarė.

Tam reikia, kad fiola būtų paliesta rankomis ir jei šiluma yra priimtina, tai ideali temperatūra pridėti atitinkamą kiekį defibrinuoto kraujo (50 ml / l agaro). Švelniai sumaišykite, kad homogenizuotumėte.

Svarbus dalykas yra kraujo agregato pasiskirstymas, nes jei tai daroma tada, kai terpė yra labai karšta, raudonieji kraujo kūneliai sulūžsta ir terpė nebus skirta hemolizei stebėti.

Jei jis yra per šaltas, susidarys gabalėliai ir terpės paviršius nebus sklandus, kad fleita būtų tinkama.

Supilkite į Petri lėkšteles

Po homogenizavimo patiekite steriliuose Petri lėkštelėse. Į kiekvieną Petri lėkštelę supilama apie 20 ml. Ši procedūra atliekama laminarinio srauto gaubte arba šalia žiebtuvėlio.

Kai patiekiami kraujo agaras Petri lėkštelėse, ant plokštelės paviršiaus neturi likti oro burbuliukų. Jei taip atsitiks, Bunseno degiklio liepsna greitai pašalinama per plokštę, kad juos pašalintumėte..

Plokštelėms leidžiama sukietėti ir laikyti šaldytuve (2–8 ° C), kol jie bus naudojami. Prieš naudodami kraujo agarines plokštes reikia pasėti (leiskite jiems paimti kambario temperatūrą).

Paruoštos plokštės trunka apie 1 savaitę.

Nuorodos

1. Bayona M. Mikrobiologinės sąlygos auginimui. \ T Helicobacter pylori. Rev Col Gastroenterol 2013 m .; 28 (2): 94-99
2. García P, Paredes F, Fernández del Barrio M. (1994). Praktinė klinikinė mikrobiologija. Kadiso universitetas, 2-asis leidimas. UCA leidinių tarnyba.
3. "Agaro kraujas". Vikipedija, laisva enciklopedija. 2018 m. Gruodžio 10 d., 14:55 UTC. Gruodžio 27 2018, 01: 49 en.wikipedia.org.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologinė Bailey & Scott diagnozė. 12 red. Argentina Panamericana S.A Redaktorius.
5. CEDIVET laboratorijos veterinarijos diagnostikos centras. Gvatemala Galima rasti adresu: trensa.com.
6.  Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. (5-asis red.). Argentina, Redakcijos Panamericana S.A..