Agaro M.R.S pamatas, paruošimas ir panaudojimas



The agaras M.R.S. yra selektyvi kietoji kultūros terpė, naudojama pieno rūgšties bakterijų, ypač Lactobacillus genties, išskyrimui ir skaičiavimui. Šis agaras buvo sukurtas 1960 m. Man, Rogosa ir Sharpe, viduryje, turinčiame tą patį pavadinimą, tačiau dėl savo sudėtingumo dažnai naudojamas santrumpa M.R.S..

Jis susideda iš proteozės peptono, mėsos ekstrakto, mielių ekstrakto, gliukozės, sorbitano monoleato, dikalio fosfato, natrio acetato, amonio citrato, magnio sulfato, mangano sulfato ir agaro..

Ši kompozicija leidžia tinkamai paruošti pieno rūgšties bakterijas iš klinikinių mėginių, tokių kaip išmatos, makšties sekrecija, geriamieji mėginiai ir motinos pienas, taip pat pieno ir mėsos maisto produktai..

Klinikinėse laboratorijose jis nėra naudojamas įprastai, nes pieno rūgšties bakterijos retai dalyvauja patologiniuose procesuose. Tačiau M.R.S agaro naudojimas dažniau pasitaiko maisto mikrobiologijos srityje..

Kita vertus, šią terpę naudoja kai kurie tyrimų centrai, kurių tikslas yra tirti pieno rūgšties bakterijas.

Indeksas

  • 1 Fondas
  • 2 Paruošimas
  • 3 Naudojimas
    • 3.1 Kolonijų charakteristikos
    • 3.2 Pieno rūgšties bakterijų išskyrimas
    • 3.3 Pieno rūgšties bakterijų skaičiavimas
    • 3.4 Mokslinių tyrimų lygmeniu
  • 4 Kokybės kontrolė
  • 5 Nuorodos

Fondas

Agaro žmogus, Rogosa ir Sharpe turi gana sudėtingą sudėtį. Išskaidant funkciją, kurią atlieka kiekvienas jos komponentas, galima paaiškinti jo pagrindą.

Baltymų peptonas, mėsos ekstraktas, mielių ekstraktas ir gliukozė yra maistinės medžiagos, kurios suteikia anglies, azoto, vitaminų ir mineralų, reikalingų bakterijų augimui, šaltinį. Be to, gliukozė yra universalus energijos šaltinis, naudojamas daugelyje kultūros terpių.

Kita vertus, norint paskatinti pieno rūgšties bakterijų augimą, būtina turėti būtinus kofaktorius (katijonus) Lactobacillus ir susijusių bakterijų metabolizme; Šie junginiai yra natrio, magnio ir mangano druskos.

Be to, sorbitano monoleaatas arba polisorbatas 80 yra svarbių riebalų rūgščių šaltinis, kai jos absorbuojamos kaip maistinės medžiagos..

Be to, sorbitano monoleaatas ir amonio citratas veikia slopindami lydinčios floros, ypač gram-neigiamų bakterijų, vystymąsi, užtikrindami selektyvų šio agaro pobūdį..

Galiausiai, agaro agaras yra tas, kuris suteikia terpei kietą konsistenciją.

Yra ir kitų „Man Rogosa Sharpe“ agaro variantų; vienas iš jų yra papildytas cisteinu (M.R.S.c), labai naudingu bifidobakterijų išskyrimui tarp kitų mikroorganizmų. Kita vertus, yra MRS terpė, papildyta neomicinu, paromomicinu, nalidikso rūgštimi ir ličio chloridu, ypač selektyviam bifidobakterijų skaičiavimui pieno produktuose..

Paruošimas

Pasverkite 68,25 g dehidratuotos terpės ir ištirpinkite vienu litru distiliuoto vandens. Leiskite stovėti 5 minutes. Visiškai ištirpinkite, į šilumos šaltinį dažnai maišykite ir užvirkite 1–2 minutes. Sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių.

Kai paliekate autoklave, palikite keletą minučių ir vis dar karštu steriliuose Petri lėkštelėse.

Leiskite kietėti ir apversti plokšteles, užsakyti plokštelėse ir laikyti šaldytuve iki naudojimo. Prieš naudodami plokšteles, palikite kambario temperatūrą.

Terpės pH turi būti 6,4 ± 0,2. Kai kurie komerciniai namai rekomenduoja pH nuo 5,5 iki 5,9.

Dehidratuota terpė yra smėlio ir paruošta tamsiai gintarinė.

Dehidratuota terpė ir paruoštos plokštės turi būti laikomos 2–8 ° C temperatūroje.

Naudojimas

Agaro plokštės M.R. jie gali būti sėti ant paviršiaus (išsekimas arba su Drigalskio mentele). Jis taip pat gali būti sėjamas giliai. Plokštelės turi būti inkubuojamos 37 ° C temperatūroje mikroaerofilinėje medžiagoje (4% O2 ir 5–10% CO2) 24–72 val.

Sėjimo metodas parenkamas pagal siekiamą tikslą (izoliacija arba skaičiavimas).

Kolonijų charakteristikos

Prognozuojamos Lactobacillus kolonijos auga blyškiai ir ant agaro turi gleivinę arba kreminę išvaizdą. Tada jie turi nustatyti.

Pieno rūgšties bakterijų išskyrimas

Šiuo tikslu naudojamas sodinimas pagal paviršių. Pasodintiems mėginiams reikia atlikti ankstesnę procedūrą. 

Krūties pieno mėginių atveju rekomenduojama centrifuguoti 1 ml mėginio 14 000 rmp 10 minučių, kad būtų pašalintas riebalinis sluoksnis. 900 μl išmesti, o likusiuose 100 μl nuosėdos suspenduojamos ir pilamos ant M.R. Tada jis turi būti tolygiai paskirstytas su Drigalskio mentele.

Išmatų mėginių atveju pasveriamas vienas (1) gramas išmatų ir homogenizuojamas 9 ml 0,1% sterilaus peptonuoto vandens, atitinkančio 1/10 praskiedimą. Tada atliekami nuoseklūs praskiedimai, kol gaunamas galutinis skiedimas 10-4.

Galiausiai imama 100 μl skiedimo 10-2, 10-3 ir 10-4 ir kiekvienas praskiedimas sėjamas į MRS agarą, vienodai pasiskirstant su Drigalski mentele.

Pieno rūgšties bakterijų skaičiavimas

Tokiu atveju sėjama pagal gylį.

Krūties pieno mėginiams paimkite 1 ml ir įdėkite į sterilų kūginį plastikinį mėgintuvėlį. MRS agaras pridedamas maždaug 40 ° C temperatūroje iki galutinio 25 ml tūrio, gaunant homogeninį mišinį. Vėliau jis vienodai supilamas į sterilius Petri lėkšteles ir paliekamas stovėti tol, kol jis polimerizuojasi..

Skiediniai yra atliekami išmatų mėginiams, kaip aprašyta aukščiau. Paimkite 1 ml kiekvieno praskiedimo ir padėkite į sterilius kūginius plastikinius mėgintuvėlius. Ištirpintas MRS agaras pridedamas iki 25 ml tūrio.

Kiekvieno praskiedimo mišinys pilamas vienodai į sterilius Petri lėkšteles. Galiausiai leiskite jam stovėti iki polimerizacijos.

Mokslinių tyrimų lygmeniu

Kasdien pieno rūgšties bakterijų tyrimas tampa įdomesnis; visų pirma mokslininkai siekia žinoti naujus padermes ir jų potencialą kaip inicijavimo fermentų gamybą pieno produktų gamyboje, be kita ko,.

Šia prasme Alvarado ir kt. (2007) panaudojo M.R. atlikti tyrimą, kuriame jie izoliuoti, identifikuoti ir apibūdinti pieno rūgšties bakterijas, esančias amatininkų rūkytoje Venesuelos sūriu.

Sūriu jie aptiko Lactococcus ir Lactobacillus genties bakterijų buvimą ir padarė išvadą, kad izoliuotų padermių mišiniai yra tinkami naudoti kaip pasterizuoto pieno sūrių gamybos pradžios padermės..

Kita vertus, Sánchez et al. (2017) naudojo M.R.S agarą. ištirti pieno rūgšties bakterijų buvimą paršelių virškinimo trakte, siekiant juos naudoti kaip vietinius probiotikus, kurie padidina sveikų paršelių produktyvumą.

Su šia terpe jie sugebėjo izoliuoti keturias rūšis: Lactobacillus johnsonii, Lactobacillus brevis, Enterococcus hirae ir Pediococcus pentosaceus.

Be to, Báez et al. (2019) panaudojo M.R. įvertinti pieno rūgšties bakterijas (BAL) ir bifidobakterijas, turinčias probiotinį potencialą motinos piene ir kūdikių išmatose..

Jie sugebėjo izoliuoti 11 BAL ir 3 Bifidobacteria sp motinos piene, 8 BAL ir 2 Bifidobacteria sp. išmatose Visi įvykdė tam tikrus parametrus, kurie akredituoja juos kaip bakterijas su probiotiniu aktyvumu.

Autoriai padarė išvadą, kad vien tik krūtimi maitinamų kūdikių pienas ir išmatos yra natūralūs probiotinių bakterijų šaltiniai.

Kokybės kontrolė

Įvertinti M.R.S. kontrolinius padermes galima naudoti, pavyzdžiui:

Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Lactobacillus casei ATCC 393, Bifidobacterium bifidum ATCC 11863, Lactobacillus plantarum MKTA 8014, Lactobacillus lactis MKTA 19435, Pediococcus damnosus MKTA 29358, Escherichia coli ir Bacillus cereus.

Tikėtini rezultatai yra patenkinamas pirmųjų 6 bakterijų augimas E. coli ir Bacillus cereus turi būti visiškai sustabdytas.

Nuorodos

  1. Alvarado C, Chacón Z, Otoniel J, Guerrero B, López G. Andų rankų darbo rūkyto venezueliško sūrio pieno rūgšties bakterijų išskyrimas, identifikavimas ir apibūdinimas. Jo naudojimas kaip starterio auginimas. Mokslininkas (Maracaibo) 2007; 17 (3): 301-308. Galima rasti adresu: scielo.org.
  2. Sánchez H, Fabián F, Ochoa G, Alfaro izoliavimas iš pieno rūgšties bakterijų nuo paršelio virškinimo trakto. Rev. veterinarijos gydytojas. Peru 2017; 28 (3): 730-736. Galima rasti adresu: scielo.org.
  3. Báez E, González G, Hernández G, López E, Mega M. Pieno rūgšties bakterijų ir Bifidobakterijų, turinčių probiotinį potencialą pieno ir kūdikių išmatose, vertinimas Acevedo savivaldybėje, Miranda 2017. Bioanalizė Karabobo universitetas, Venesuela.
  4. Britų laboratorija M.R.S agaras. 2015 m. Galima rasti adresu: britanialab.com
  5. Vikipedijos kūrėjai. MRS agaras Vikipedija, „Laisvas enciklopedija“. 2018 m. Sausio 10 d., 19:44 UTC. Prieinama adresu: wikipedia.org Prieiga prie 2019 m. Vasario 17 d.
  6. Roy D. Žiniasklaida bifidobakterijų atskyrimui ir skaičiavimui pieno produktuose. Int J Food Microbiol, 200128; 69 (3): 167-82.