Agaras turi standartinį pamatą, paruošimą ir naudojimą

The standartinis sąskaitos agaras yra kieta, neselektyvi auginimo terpė, skirta aerobinio mikrobiologinio krūvio kiekybiniam įvertinimui geriamojo vandens, nuotekų, pieno gėrimų mėginiuose, be kitų maisto produktų. Ši terpė taip pat žinoma kaip PCA agaras, jo akronimas anglų kalba „Plate Count Agar“. 1953 m. Ją sukūrė Buchbinder, Baris ir Goldstein.

Standartinę agaro terpę sudaro mielių ekstraktas, tripteinas, gliukozė, agaras ir distiliuotas vanduo. Ši formuluotė apima pagrindinius mitybos elementus, leidžiančius plėtoti dabartinę aerobinę mikrobiologinę apkrovą, kuri nėra sudėtinga.

Kadangi terpėje nėra inhibitorių, bakterijos gali išsivystyti be jokių apribojimų, todėl ji idealiai tinka bendram kolonijų skaičiui. Tačiau plokštelės kiekybinio nustatymo metodas neaptiks visų esančių bakterijų, bet tik tas, kurios gali augti tokiomis aplinkos sąlygomis, kurioms taikomas standartinis sėjamasis agaras..

Šia prasme plokštelės kiekybinio nustatymo metodu siekiama nustatyti bendrą aerobinių mezofilinių bakterijų kiekį, t. Y. Tas, kurios išsivysto esant 25–40 ° C temperatūrai, esant optimaliai augimo temperatūrai 37 ° C temperatūroje..

Ši bakterinė grupė yra labai svarbi, nes daugeliui patogeninių bakterijų yra žmogus.

Pažymėtina, kad kartais gali būti įdomu kiekybiškai įvertinti maisto produktuose esančių psichofilinių bakterijų kiekį. Šios bakterijos yra tokios, kurios išsivysto esant žemai temperatūrai (< 20°C) y son las responsables de que los alimentos se descompongan más rápido, aun estando en nevera.

Panašiai termofilinės bakterijos, kurios išsiskiria nuo 50 ° C iki 80 ° C ar daugiau, gali būti svarbios tam tikrų rūšių maisto produktuose, pavyzdžiui, konservuotuose.

Mikrobinis kiekybinis nustatymas yra išreiškiamas kolonijas sudarančiais vienetais (CFU) grame arba mililitre mėginio.

Indeksas

• 1 Fondas
• 2 Paruošimas
  • 2.1
  • 2.2 Paviršiaus sodinimui
• 3 Naudokite
  • 3.1 Plokštelių liejimo technika (sėklai)
  • 3.2 Ant paviršiaus sėjama technika
• 4 Kokybės kontrolė
• 5 Apribojimai
• 6 Nuorodos

Fondas

Standartinė skaičiavimo terpė yra sukurta taip, kad būtų galima tinkamai patenkinti nereikalingas aerobines bakterijas, nes mielių ekstraktas, tripheinas ir gliukozė suteikia būtinas maistines medžiagas geram mikrobiologiniam vystymuisi..

Kita vertus, terpė turi aiškią spalvą ir skaidrią išvaizdą, todėl idealiai tinka eksponuoti kolonijas, sukurtas giliai sėjant (pilant į plokštelę)..

Taip pat galima suskaičiuoti kolonijas pagal sėjamosios paviršiaus metodą su Drigalskio mentele.

Kai mikrobiologinė apkrova yra didelė, tiriamo mėginio dešimtainiai tirpalai turi būti skaičiuojami pagal KSV.

Pažymėtina, kad šią terpę rekomenduoja Amerikos visuomenės sveikatos asociacija (APHA) aerobinių mezofilų skaičiavimui..

Paruošimas

Pasverkite 23,5 g dehidratuotos terpės ir ištirpinkite vienu litru distiliuoto vandens. Kad mišinys visiškai ištirptų, jis turi būti dažnai kaitinamas, kol jis virs. Toliau nurodyti veiksmai priklauso nuo naudojamo sėjimo metodo.

Dėl plokščių liejimo technikos

Paskirstykite 12–15 ml į mėgintuvėlius. Vėliau sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių. Leiskite sukietėti vertikaliai bloko pavidalu. Laikyti šaldytuve iki naudojimo.

Ištirpinkite lazdą, kai jis bus naudojamas. Ištirpę, laikykite jį vandens vonioje, esant 44-47 ° C temperatūrai, kai ruošiami mėginiai.

Sodinti ant paviršiaus

Medžiaga sterilizuojama autoklave 121 ° C temperatūroje ir paskui ištirpinkite 20 ml steriliuose Petri lėkštelėse. Prieš naudojimą leiskite sukietėti, apversti ir laikyti šaldytuve.

Prieš naudokite plokšteles. Terpės pH turi būti 7,0 ± 0,2.

Naudokite

Mikrobiologinės vandens ir maisto analizės metu agaro standartinis skaičius naudojamas aerobiniame mezofilų skaičiavimo metode. Reikalingas aerobinių mezofilų skaičiavimas, nes jis lemia tiriamo mėginio sanitarinę kokybę.

Šio metodo taikymas (naudojant šią terpę) leidžia makroskopiškai izoliuoti izoliuotas kolonijas jų kiekybiniam įvertinimui.

Plokščių liejimo technika (sėklų gylis)

-Procedūra

Techniką sudaro:

1) homogenizuokite mėginį, kad perskirstytų esamas bakterijas.

2) Pradinė suspensija atliekama steriliame buteliuke arba maišelyje, atsižvelgiant į santykį 10 g arba 10 ml mėginio 90 ml skiediklio (10^-1).

3) Iš pradinės suspensijos atitinkami dešimtainiai skiedimai atliekami atsižvelgiant į mėginio tipą. Pavyzdžiui: (10^-2, 10^-3, 10^-4). Skiediniai gaminami naudojant peptono vandenį arba fosfato buferį.

Norėdami tai padaryti, paimkite 1 ml pradinės suspensijos ir įpilkite 9 ml skiediklio, jei reikia, tęskite praskiedimus, išgerkdami 1 ml skiedimo.^-2 ir pan.

4) Paimkite 1 ml kiekvieno praskiedimo ir padėkite į tuščius sterilius Petri indus.

5) Į kiekvieną plokštelę įpilama 12–15 ml anksčiau ištirpinto ir 44–47 ° C temperatūros nustatyto agaro.

6) Padėkite plokštėms sklandžiai suktis, kad mėginys būtų tolygiai paskirstomas agarui ir leistų sukietėti.

7) Apverskite plokšteles ir inkubuokite 37 ° C temperatūroje aerobioze 24–48 valandas.

8) Pasibaigus laikui, pereikite prie plokštelių ištyrimo ir kolonijų skaičiavimą skiedinyje, kuris jį leidžia. Jis parenkamas skaičiuojant tas plokšteles, kuriose yra nuo 30 iki 300 CFU.

Skaičiavimas gali būti atliekamas rankiniu būdu arba gali būti naudojama kolonijų skaitiklių įranga.

Leistinos vertės vienam mililitui mėginio gali skirtis įvairiose šalyse pagal standartus, kuriais jie reguliuojami.

-UFC apskaičiavimas

Bendrasis skaičiavimas atliekamas pagal šią formulę:

Rezultatai išreiškiami 1 arba 2 skaitmenimis, padauginus iš atitinkamos bazės 10. Pavyzdys: jei rezultatas yra 16,545, jis suapvalinamas pagal trečiąjį skaitmenį iki 17.000 ir bus išreikštas taip: 1,7 x 10⁴. Dabar, jei rezultatas buvo 16,436, apvalinamas iki 16 000 ir išreiškiamas 1,6 x 10⁴.

Technika, pasodinta ant paviršiaus

-Procedūra

-Įpilama 0,1 ml tiesioginio mėginio, jei jis yra skystas, pradinė suspensija 10^-1 arba iš eilės praskiedimo 10^-2, 10^-3 ir tt, standartinės sąskaitos agaro plokštės viduryje.

-Mėginį tolygiai paskirstykite su Drigalski mentele arba L formos stiklo lazdele, leiskite stovėti 10 minučių.

-Apverskite plokšteles ir inkubuokite aerobioze 37 ° C temperatūroje 24–48 valandas.

-Apskaičiuokite kolonijas, pasirinkite tas plokšteles, kurios yra nuo 20 iki 250 CFU.

-UFC apskaičiavimas

Skaičiavimui taikomas praskiedimo koeficientas, kuris yra atvirkštinis. Skaičius suapvalinamas iki 2 reikšminių skaitmenų (apvalinant pagal trečiąjį skaitmenį) ir išreiškiamas 10 bazės galia, pavyzdžiui, jei mėginyje be praskiedimo skaičiuojama 224 CFU (10^-1), Pranešama 22 x 10¹  UFC, tačiau, jei skaičius būtų 225, pranešama 23 x 10¹ UFC.

Dabar, jei skaičiuojate 199 CFU skiedimo metu 10^-3, Bus pranešta apie 20 x 10⁴ UFC, bet jei tuo pačiu skiedimu skaičiuojamas 153 CFU, bus pranešta apie 15 x 10⁴ UFC.

Kokybės kontrolė

Standartinio auginimo terpė gali būti įvertinta naudojant žinomus sertifikuotus padermes, tokius kaip: Escherichia coli ATCC 8739, Staphylococcus aureus ATCC 6538, Bacillus subtilis ATCC 6633, Lactobacillus fermentum ATCC 9338, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228, Shigella flexneri ATCC 12022.

Jei auginimo terpė yra optimaliose sąlygose, visais atvejais, išskyrus L. fermentum kuri gali turėti reguliarų našumą.

Siekiant įvertinti auginimo terpės sterilumą, po vieną arba dvi kiekvienos paruoštos partijos plokšteles (neužkrėstas) reikia inkubuoti 37 ° C temperatūroje aerobioze 24 valandas. Šio laiko pabaigoje nereikėtų stebėti terpės augimo ar spalvos pokyčių..

Apribojimai

-Negalima ištirpinti agaro daugiau nei vieną kartą.

-Paruošta terpė gali trukti iki 3 mėnesių, kol ji laikoma šaldytuve ir apsaugota nuo šviesos.

-Ši terpė netinka mikroorganizmams ir anaerobams.

Nuorodos

1. Nacionalinė vaistų administracija Maisto ir medicinos technologijos (ANMAT). Maisto mikrobiologinė analizė, oficiali analitinė metodika, indikatoriniai mikroorganizmai. 2014 3 tomas. Galima rasti adresu: anmat.gov.ar
2. Difco Francisco Soria Melguizo Laboratories, S.A. Plokštelių skaičius Agar. 2009 m.: Http://f-soria.es
3. Laboratorijos Conda Pronadisa. Agaras standartiniams metodams (PCA) pagal APHA ir ISO 4833. Prieinamas adresu: condalab.com
4. Laboratorijos Britanija. Skaičiuojama ant agaro plokštės. 2015 m. Galima rasti adresu: britanialab.com
5. Camacho A, Giles M, Ortegón A, Palao M, Serrano B ir Velázquez O. 2009. Maisto produktų mikrobiologinės analizės metodai. 2nd ed. Chemijos fakultetas, UNAM. Meksika Pateikiama adresu: depa.fquim.unam