Voges-Proskauer bandymų pagrindas, paruošimas ir naudojimas



The Voges-Proskauer testas yra biocheminis tyrimas, skirtas padėti identifikuoti Enterobacteriaceae šeimos bakterijas. Ypač naudinga atskirti Escherichia coli nuo Klebsiella ir Enterobacter, be kita ko.

Bandymas atliekamas skystoje kultūros terpėje, vadinamoje metilo raudona-Voges Proskauer, geriau žinoma akronimu RM / VP. Ši terpė susideda iš buferinio poliponono, gliukozės, dikalio fosfato ir distiliuoto vandens.

Dabartinė RM / VP terpė yra Clark ir Lubs terpės modifikacija, kuri iš pradžių turėjo mažesnę peptonų ir gliukozės koncentraciją. Todėl buvo sukurta mažiau vandenilio jonų, reikalingų teigiamai Voges-Proskauer reakcijai.

Bandymas grindžiamas mikroorganizmo gebėjimu naudoti gliukozę per butileno glikolio maršrutą ir sudaryti neutralų galutinį produktą, vadinamą acetoinu, esant deguoniui ir šarminiam pH..

RM / VP terpėje, be to, kad galėtų atskleisti Voges-Proskauer testą, taip pat gali būti atskleistas metilo raudonasis bandymas.

Indeksas

  • 1 Fondas
    • 1.1 Voges-Proskauer testo pagrindas
    • 1.2 Bandymo ir aiškinimo pagrindai
  • 2 Paruošimas
    • 2.1 Medium RM / VP
    • 2.2 Vogai A Reagentas
    • 2.3 Voges B reagentas
  • 3 Voges-Proskauer testo procedūra
    • 3.1 Bandymo parengimas
  • 4 Naudokite
  • 5 Kokybės kontrolė
  • 6 Nuorodos

Fondas

Voges-Proskauer testo pagrindas

Pluripeptonas, esantis terpėje, užtikrina mitybos poreikius, būtinus bakterijų augimui. Savo ruožtu gliukozė yra pagrindinis junginys. Daugelis bakterijų geba metabolizuoti gliukozę ir sudaro piruvino rūgštį.

Piruvinė rūgštis yra vidurinis gliukozės metabolizmo taškas, iš kurio kiekvienas mikroorganizmas gali būti skirtingas. Kai kurios iš jų sudarys mišrias rūgštis, tokias kaip pieno rūgštis, acto rūgštis, skruzdžių rūgštis ir gintaro rūgštis, o kitos sudarys neutralius produktus, tokius kaip 2,3-butandioolis..

Voges-Proskauer testas atskleidžia mikroorganizmo gebėjimą sudaryti acetilmetilkarbinolį (acetoiną), kuris yra tarpinis 2,3-butandioolio produktas aerobinėmis sąlygomis..

Acetoinas redukuojamas ir sudaro 2,3-butandioolį, tačiau ši reakcija yra grįžtama, todėl, jei 2,3-butandioolis yra oksiduotas, susidaro acetoinas. Todėl būtinas deguonis.

Dikalio fosfatas yra buferis, kuris slopina mišinį pH 6,9 ± 0,2..

Bandymo ir aiškinimo pagrindas

Kad būtų parodyta reakcija, turi būti atliktas dviejų reagentų (Barrito reagentų), vadinamų „Voges A“ ir „Voges B“, kūrimas..

Voges A yra 5% α-naftoolio tirpalas, o Voges B yra 40% kalio hidroksido preparatas. Jei nėra kalio hidroksido, jį galima pakeisti 40% natrio hidroksidu.

Α-naftalas yra katalizatorius, kuris padidins reakcijos spalvos intensyvumą, todėl bandymas tampa jautresnis. Pirmiausia a-naftolį reikia papildyti, maišant mėgintuvėlį taip, kad terpė susiliestų su deguonimi. Tokiu būdu esamas acetoinas yra oksiduojamas į diacetilą, ir 2,3-butanediolis oksiduojamas, kad susidarytų acetoinas, perkeliant jį į diacetilą.

Taip a-naftalas prisijungs prie diacetilo, kuris savo ruožtu buvo susietas su guanidino branduoliu, esančiu aminorūgštyje argininu, kuris yra iš pluripeptono..

Savo ruožtu kalio arba natrio hidroksidas yra atsakingas už CO absorbciją2 ir reaguoja su peptonais. Ši reakcija sukelia rausvos ir lašišos spalvos susidarymą, aiškiai matomą po to, kai labai gerai purtant mėgintuvėlį.

Kad spalva iš karto atsirastų, turi būti sumaišyti tinkami diacetilo, peptono ir α-naftolio kiekiai. Jei taip nėra, leiskite mėgintuvėlį palikti 15 minučių prieš vertimą.

Paprastai bandymas yra teigiamas po 2–5 minučių, kai pastebima silpna rožinė spalva. Jei paliekama 30 minučių iki 1 valandos, spalvos intensyvumas bus maksimalus (giliai raudonas).

Neigiamas testas bus akivaizdus, ​​kai sultinys yra geltonas. Po 1 valandos, jei bandymas yra neigiamas, gali susidaryti vario spalva dėl kalio hidroksido reakcijos į α-naftolį..

Paruošimas

Medium RM / VP

Pasverkite 17 g dehidratuotos terpės ir ištirpinkite vieną litrą distiliuoto vandens. Leiskite stovėti 5 minutes. Visiškai ištirpinkite iki virimo. Patiekiama 3–4 ml mėgintuvėlių ir sterilizuokite autoklave 121 ° C temperatūroje 15 minučių.

Dehidratuota terpė yra smėlio spalvos ir paruošta terpė yra šviesiai gintarinė.

Galutinis terpės pH yra 6,9 ± 0,2.

Voges A Reagentas

Pasverkite 5 g α-naftoolio ir ištirpinkite 50 ml etilo alkoholio (absoliutus). Vėliau įpilkite etilo alkoholio, kad užpildytumėte iki 100 ml.

Reagentas Voges B

Pasveriama 40 g kalio hidroksido ir ištirpinama 50 ml distiliuoto vandens stiklinėje. Stiklas turi būti patalpintas į šalto vandens vonią, kad būtų galima kontroliuoti temperatūrą, nes preparato ištirpinimo metu staiga pakyla.

Po to, kai tirpalas yra šaltas, jis perkeliamas į graduotą balioną ir distiliuotu vandeniu supilamas iki 100 ml.

Voges-Proskauer testo procedūra

Norint atlikti Voges-Proskauer testą, tiriamasis mikroorganizmas inokuliuojamas RM / VP sultiniu, iš grynos 18–24 valandų kultūros.

Inokuliatas neturėtų būti per tankus. Jis inkubuojamas 35-37 ° C temperatūroje 24–48 valandas, nors kartais reikia inkubuoti keletą dienų. „Cowan and Steel“ mano, kad 5 dienos yra minimalus inkubacinis laikas, reikalingas visoms „Enterobacteriaceae“ šeimos teigiamoms Voges-Proskauer (VP) rūšims aptikti..

Bandymo parengimas

1 ml alikvotinę dalį atskirkite mėgintuvėliu ir atlikite tokį vystymąsi: įpilkite 12 lašų (0,6 ml) Voges A reagento ir 4 lašus (0,2 ml) Voges B. Sumaišykite, kad aeruotumėte ir palikite stovėti prieš 5 - 10 minučių. Tačiau jei bandymas vis dar yra neigiamas, leiskite jam stovėti ir stebėti vamzdelį po 30 minučių iki 1 valandos.

Rožinės raudonos spalvos išvaizda rodo, kad Voges-Proskauer reakcija yra teigiama. Jei terpė lieka geltona, reakcija yra neigiama.

Kad išvengtumėte klaidingų negatyvų, būtina, kad kūrėjai pridėtų nurodytą tvarką ir kiekį.

Naudokite

Voges-Proskauer testas yra naudingas norint atskirti E. coli Klebsiella, Enterobacter, Serratia gentys, kurios yra VP teigiamos.

Kokybės kontrolė

Kontrolinės padermės gali būti naudojamos paruoštos terpės kokybei patikrinti. Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC 700603, Proteus mirabilis ATCC 43071, Salmonella typhimurium ir. \ T Enterobacter cloacae ATCC 13047.

Tikėtini rezultatai yra tik teigiami „Voges-Proskauer“ reakcijos K. pneumoniae ir E. cloacae. Likusi dalis yra neigiama.

Nuorodos

  1. Laboratorijos Britanija. MR-VP Medium. 2015 m. Galima rasti adresu: www.britanialab.com
  2. „Microkit Laboratories“ M-Ident Voges Proskauer. 2014. Galima: http://www.medioscultivo.com
  3. Mac Faddin J. (2003). Biocheminiai klinikinės reikšmės bakterijų identifikavimo tyrimai. 3-asis red. Redakcinė Panamericana. Buenos Airės Argentina.
  4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologinė Bailey & Scott diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana S.A. Argentina.
  5. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5th ed. Redakcija Panamericana S.A. Argentina.