DNR sekos nustatymas Maxam-Gilbert, Sanger metodas, pavyzdžiai

The DNR sekos nustatymas (deoksiribonukleino rūgštis) yra molekulinės biologijos laboratorijose atliekama procedūra, leidžianti žinoti nukleotidų tvarką dominančioje genetinėje medžiagoje. Be to, taip pat galima nustatyti RNR (ribonukleino rūgšties) sekvenavimą.

Šis metodas buvo būtinas biologinių mokslų plėtrai. Jis taip pat taikomas kitoms žinių sritims, pavyzdžiui, medicininei diagnozei ir teismo tyrimams.

Anksčiau DNR grandinės seka buvo laikoma lėta ir brangi veikla, kuri leido identifikuoti tik keletą bazinių porų oligonukleotiduose..

Šiandien, su visais mokslo pasiekimais, DNR seka yra įprastinė operacija daugelyje laboratorijų visame pasaulyje dėl beveik 50 metų šios srities tyrimų. Kalbant apie grandinės ilgį, labai trumpą laiką galite sekti iki milijonų bazinių porų.

Norint tai padaryti, yra sukurta daugybė metodų, kurie skiriasi kainomis ir tikslumu. Šiame straipsnyje aprašysime klasikines ir modernias technologijas, kurių kiekvienas turi savo privalumų ir trūkumų.

Iki šiol sekos metodai leidžia gauti pilnų genomų seką nuo mažų prokariotų ir mielių iki žmogaus genomo.

Indeksas

• 1 DNR struktūra
• 2 Istorija
• 3 Sanger metodas
  • 3.1 Pagrindiniai reakcijos komponentai
  • 3.2 Rezultatų skaitymas
• 4 Automatinis sekos nustatymas
• 5 Maxam-Gilbert sekos nustatymas
  • 5.1 Procedūra
  • 5.2 Rezultatų skaitymas
• 6 Masinis sekos nustatymas
  • 6.1
  • 6.2 Sekos nustatymas pagal sintezę
  • 6.3 Suskirstymas pagal ligas
  • 6.4 Ion Torrent sekos nustatymas
• 7 Pavyzdžiai
  • 7.1 Žmogaus genomo sekvenavimas
• 8 Svarba ir taikymas
• 9 Nuorodos

DNR struktūra

Norint suprasti DNR sekos nustatymo metodus ir metodus, būtina žinoti tam tikrus pagrindinius molekulės struktūros ir sudėties aspektus.

DNR yra biomolekulė, randama visose gyvybėse, nuo bakterijų iki didelių vandens gyvūnų. Organelėse - kaip ir mitochondrijose ir chloroplastuose - yra jų apykaitinė DNR molekulė. Net kai kuriuose virusuose nustatyta genetinė medžiaga yra DNR.

Struktūriškai DNR yra nukleotidų rinkinys. Kiekvienas jų yra integruotas angliavandenių, azoto bazės (A, T, C arba G) ir fosfatų grupės. DNR sekos tikslas - atskleisti keturių azoto bazių sekos seką.

Istorija

1950-ųjų viduryje mokslininkai Watson ir Crick aprašė DNR struktūrą, naudodami krikščioniškus metodus. Tačiau nė vienas iš šių mokslininkų negalėjo rasti būdų sekti seką.

Nors buvo tam tikrų pirmtakų, svarbiausias įvykis buvo Sangero metodo sukūrimas 1977 m. Metodo tėvas Frederikas Sangeras buvo britų biochemikas, dviejų Nobelio premijų laureatas už didžiulį indėlį į biologijos mokslus.

Šis metodas literatūroje taip pat žinomas kaip „grandinės nutraukimas“ arba dideoksinukleotidai. Toliau aprašysime šios technikos principus ir tuos, kurie buvo sukurti remiantis jo tobulinimu ir naujovėmis.

Sangerio metodas

Sangerio metodo kūrimas buvo esminis molekulinės biologijos įvykis. Jis apima pagrindinius DNR replikacijos proceso komponentus, kurie paprastai vyksta ląstelėje, bet pridedant specialų komponentą: dideoksinukleotidai.

Pagrindinės reakcijos sudedamosios dalys

- DNR polimerazė: fermento DNR polimerazė yra esminis proceso elementas. Ši molekulė dalyvauja DNR grandinės replikacijoje ir jos vaidmuo yra naujos grandinės sintezė, atitinkanti dezoksiribonukleotidų trifosfatą su papildomais..

Atminkite, kad DNR tyminai (T) yra sujungti su adeninais (A) dviem vandenilio jungtimis, o citozinas (C) su guaninu (G) - tris tiltus.

- Nukleotidai: Sanger sekvenavimas apima dviejų tipų nukleotidus, keturis 2'-dezoksinukleotidus (sutrumpintus kaip dATP, dGTP, dCTP ir dTTP) ir keturis dideoksinukleotidus (ddATP, ddGTP, ddCTP ir ddTTP).

Nors dideoksinukleotidai yra panašūs į monomerus, kurie paprastai įterpiami į DNR, jų struktūroje trūksta -OH grupės. Dėl to neįmanoma į grandinę pridėti naujo nukleotido.

Todėl, kai dedamas specialus nukleotidas - visiškai atsitiktinai - į formavimo grandinę, sintezė yra paralyžiuota. Tokiu būdu, reakcijos pabaigoje yra skirtingo dydžio grandinės, kiekviena iš jų, kur reakcija buvo sustabdyta kitame taške.

Eksperimentiškai keturi bandymai. Kiekviename yra DNR, išgauti iš biologinio mėginio, normalių nukleotidų ir vieno iš keturių tipų specialių nukleotidų. Arba specialieji nukleotidai pažymėti tam tikru fluorescencinio žymeklio tipu (žr. Toliau automatizuotą seką).

Rezultatų skaitymas

Pirmasis žingsnis yra atskirti kiekvieną sintezuotą grandinę pagal jų dydį. Kai kurie bus ilgesni nei kiti, priklausomai nuo to, kur buvo įtrauktos specialios bazės.

Yra skirtingų biocheminių metodų, leidžiančių atskirti mišinio komponentus, naudojant dydį kaip diskriminacinę savybę. Sanger metodu skirtingos grandinės yra atskiriamos elektroforezės būdu. Sudėtingiausiuose technikos variantuose naudojama kapiliarinė elektroforezė.

Taigi, ilgesnės juostos perkeliamos mažiau nei trumpesni variantai. Tada ši sistema pereina per skaitytuvą, kuris atpažįsta žymeklį, įtrauktą į kiekvieną dideoksinukleotidą. Tokiu būdu sekos seka gali būti žinoma.

Ši „pirmosios kartos“ technika gali nuskaityti ne daugiau kaip 1 kilobazę DNR fragmentus. Šiuo metu „Sanger“ metodas naudojamas keliose laboratorijose, dažniausiai moderniuose variantuose. Be to, jis naudojamas patvirtinti rezultatus, gautus naudojant sudėtingiausius metodus, bet mažiau tikslius.

Automatinis sekos nustatymas

Kai reikia atlikti didelio masto seką, procesą paspartina automatizavimas. Tai yra „Sanger“ grandinės nutraukimo metodo variantas, kai gruntai pažymėti fluorescenciniais produktais, kad juos būtų galima atskirti.

Vėliau reakcijos produktas vyksta elektroforezėje - viskas vienoje juostoje. Kai kiekvienas fragmentas palieka galutinę gelio dalį, jis greitai atpažįstamas pagal fluorescencinę etiketę su 1% klaida.

Sudėtingiausiose sistemose yra iki 96 kapiliarinių vamzdžių sistema, valdoma kompiuteriu, prijungtu prie roboto. Tai reiškia, kad vienu metu galima įvertinti 96 DNR mėginius. Taigi procesas, apimantis elektroforezę ir rezultatų analizę, yra visiškai automatizuotas.

Vieną dieną šios sistemos gali suskirstyti iki 550 000 bazių. Proceso metu žmogiškasis darbas yra nereikalingas, metodas pradedamas tik apie 15 minučių.

Sekos nustatymas pagal Maxam-Gilbert

Tuo pačiu metu, kai Sanger paskelbė savo darbą, du tyrėjai, pavadinti Allan Maxan ir Walter Gilbert, sugebėjo sukurti kitą metodą DNR sekai gauti. Metodas įgijo populiarumą tuo metu, tačiau vėliau jį pakeitė Sangerio metodas.

Priešingai nei Sangero metodas, Maxan ir Gilbert sekos (arba cheminės sekos nustatymas, kaip žinoma) neapima hibridizacijos reakcijų. Metodiką sudaro ženklinimas reaktyviais agentais viename gale, po to atliekamas valymo procesas.

Vienas iš neigiamų šio metodo aspektų yra jo didžiulis sudėtingumas ir naudotojams pavojingų cheminių medžiagų naudojimas. Cheminius gedimus sukelia DMS, skruzdžių rūgšties, hidrazino ir hidrazino naudojimas su druskomis.

Procedūra

Protokolas prasideda ženklinimu juostos 5 'gale su fosforo žymekliu 32, tada vyksta azoto bazės cheminis modifikavimas ir jis yra atskiriamas. Galiausiai atsiranda abaziško regiono suskaidymas.

Pirmiausia grandinė, kurią reikia suskirstyti, sutrumpinama į mažesnius segmentus. Šis žingsnis atliekamas su restrikcijos fermentais, dėl kurių atsiranda išskirtinių kraštutinumų.

Toliau reakcija atliekama su šarminiu fosfataze, kurios tikslas yra pašalinti fosfatų grupę. Taigi ženklinimui atlikti gali būti naudojama polinukleotido kinazė.

Grandinė denatūruota (dvi atviros sijos). Tada pradėsime taikyti chemines medžiagas. Šios skilimo reakcijos atliekamos kontroliuojamomis sąlygomis ir kokios rūšies obligacijos yra sulaužytos kiekviena naudojama cheminė medžiaga.

Rezultatų skaitymas

Kaip ir Sangerio metode, rezultatų skaitymas apima grandinių, gautų elektroforezės sistemoje, atskyrimą pagal dydį. Sistemos, sudarytos iš poliakrilamido, leidžia gauti labai tinkamą skiriamąją gebą skaityti.

Masinis sekos nustatymas

Masyvi seka susideda iš naujų metodų, sutrumpintų kaip NGS, iš anglų kalbosNaujos kartos seka ".

NGS reikalaujantys metodai reikalauja ankstesnio DNR amplifikacijos etapo (jie neveikia su viena molekule). Be to, naudojamos platformos labai skiriasi. Toliau bus aprašyti populiariausių metodų principai:

Pirozės nustatymas

Tai apima pirofosfato išsiskyrimo, kuris atsiranda kiekvieną kartą įdėjus naują DNR grandinę, stebėjimą. Fermentų sistema yra sujungta, kad šviesos spinduliuotė (kuri yra aptinkama fotoaparatu) įvyktų kiekvieną kartą, kai įjungiamas naujas nukleotidas..

Procesas prasideda atskiru kiekvieno azoto pagrindo inkubavimu, siekiant patikrinti, ar yra šviesos emisija. „Pyrosequencing“ gali atlikti ilgų sričių skaitymą, tačiau nustatytas klaidų lygis yra didelis.

Sekvenavimas pagal sintezę

Tai apima žymėtų nukleotidų įtraukimą. Šie fluorescenciniai komponentai pridedami, plaunami ir įvedamas įtrauktas nukleotidas. Tada nukleotidų ženklinimas yra pašalinamas, o grandinės sintezė gali tęstis. Kitame etape taip pat bus įtrauktas pažymėtas nukleotidas, ir minėti veiksmai bus pakartoti.

Vienas šios technikos trūkumas atsiranda tada, kai fluorescenciniai žymenys nėra visiškai pašalinti. Šie išmetamieji teršalai sukuria fono klaidas, dėl kurių atsiranda didelių klaidų.

Suskirstymas pagal ligas

Šis metodas skiriasi nuo kitų, nes nenaudoja DNR polimerazės. Vietoj to pagrindinis šio metodo fermentas yra ligazė. Čia naudojami DNR fragmentai, pažymėti fluorescenciniu būdu, yra surišti fermento ir aptikti.

Didžiausia šios technikos problema yra labai trumpas fragmento ilgis, galintis apdoroti.

Jonų sekos Torrent

Šis metodas pagrįstas H jono matavimu⁺ kuris yra išleidžiamas kiekvieną kartą įtraukiant naują nukleotidą. Šis principas yra gana panašus į pirosequencing, bet daug pigiau.

Pavyzdžiai

Žmogaus genomo sekvenavimas

Žmogaus genomo seka buvo vienas iš perspektyviausių biologijos iššūkių, taip pat vienas iš pripažintų konkurencijos mokslo istorijos istorijoje. Tiesą sakant, projekte dalyvavusiems mokslininkams genomas tapo seka.

1990 m. Jis pradėjo vadinti „žmogaus genomo projektu“, kuriam vadovavo žinomas mokslininkas, Nobelio premijos laureatas Jamesas Watsonas. Po vienerių metų, 1991 m., „Venter“ imasi iššūkio „pataikyti“ Watsoną ir sekti jo genomą. Tačiau 1992 metais Watson išėjo į pensiją ir komandą priėmė kitas tyrėjas.

1995 m. Venter paskelbė sėkmingą bakterijų genomo sekvenavimą pagal atsitiktinį sekos nustatymo metodą. Panašiai prieš metus komanda paskelbė mielių genomo sekvenavimą.

2000 metais varžybos buvo nutrauktos. Abi bendrovės paskelbė preliminarius viso genomo rezultatus dviejuose prestižiškiausiuose mokslo žurnaluose: Gamta ir Mokslas.

Tačiau mokslininkai toliau tobulino pasiūlymus, o 2006 m. Sekos buvo baigtos tam tikromis žmogaus chromosomomis.

Svarba ir taikymas

Žinant molekulės, kaip svarbios DNR, nukleotidų tvarką, yra naudinga biologams ir susijusiems specialistams. Šioje polinukleotidų grandinėje yra visa informacija, reikalinga visų gyvybės formų kūrimui ir palaikymui.

Dėl šių priežasčių žinios apie šią seką yra būtinos biologiniams tyrimams. Iš esmės sekos leidžia mums įvertinti vieną iš svarbiausių biologinių sistemų savybių ir nustatyti skirtumus tarp jų.

Suskirstymą plačiai naudoja taksonomai ir sistematikai, nes tam tikros DNR sekos leidžia nustatyti kriterijus, leidžiančius nustatyti, ar du organizmai priklauso tai pačiai rūšiai, ar gali pasiūlyti hipotezes apie jų filogenetinius ryšius..

Be to, DNR sekos yra taikomos medicinos ir diagnostikos srityse. Pavyzdžiui, yra prieinamų ir prieinamų sistemų, kurios sekos nustatymu leidžia įvertinti tendenciją kurti tam tikras ligas (pvz., Vėžį), naudojant vadinamuosius paprastus nukleotidų polimorfizmus (SNP)..

Kriminalistinio ir teismo ekspertizės tyrimai taip pat buvo praturtinti sekos nustatymo metodais ir gali būti naudojami kaip patikimi įrodymai, kad tam tikras asmuo dalyvauja nusikaltime..

Nuorodos

1. Heather, J. M., ir Chain, B. (2016). Sekvenavimo seka: DNR sekvenavimo istorija. Genomika, 107(1), 1-8.
2. Koboldtas, D.C., Steinbergas, K. M., Larsonas, D. E., Wilsonas, R.K., ir Mardis, E.R. Kita kartos sekos revoliucija ir jos įtaka genomikai. Ląstelė, 155(1), 27-38.
3. Levy, J. (2010). Mokslinės varžybos. Nuo „Galileo“ iki žmogaus genomo projekto. Paraninfo Redakcija.
4. Sanger, F., Nicklen, S., & Coulson, A. R. (1977). DNR sekvenavimas su grandinės gale esančiais inhibitoriais. Nacionalinės mokslų akademijos darbai, 74(12), 5463-5467.
5. Schuster, S. C. (2007). Naujos kartos seka transformuoja šiandienos biologiją. Gamtos metodai, 5(1), 16.
6. Xu, J. (Red.). (2014). Naujos kartos seka. Caister Academic Press.