Proteinazės K charakteristikos, fermentinis aktyvumas ir panaudojimas



The proteinazė K yra fermentas, priklausantis serino proteazių grupei, tai yra, jo aktyviame kataliziniame centre yra aminorūgšties serinas ir turi funkciją, kad jie suskaidytų peptido jungtis hidrolizės būdu. Savo ruožtu šis fermentas priklauso subtilizinų (peptidazės S8) baltymų šeimai..

Proteinazės K molekulinė masė (MW) yra 28 900 daltonų ir pirmą kartą buvo išskirta 1974 m. „Engyodontium“ albumas, anksčiau žinomas pagal. \ t Tritirachium albumas Limber.

Ji pasižymi dideliu proteolitiniu pajėgumu, įrodyta, kad gali suskaidyti plaukuose esantį keratiną. Žodis keratinas anglų kalba yra parašytas "keratinu", todėl jis buvo vadinamas "proteinaze K".

Dėl savo didelio gebėjimo išskirti natūralius baltymus šis fermentas yra naudingas įvairiose molekulinės biologijos metoduose. Jis daugiausia naudojamas izoliuoti ir paruošti nukleino rūgštis, turinčias didelę molekulinę masę (MW)..

Proteinazė K veikia atpalaiduodama branduolinę DNR, o sunaikindama baltymus ir inaktyvuodama RNazes ir DNazes, ty pašalina DNR ir RNR preparatuose esančias nukleozes..

Kita vertus, pastebėta, kad proteinazė K gali hidrolizuoti kai kuriuos denatūruotus vietinius baltymus, kurie sukėlė tyrėjų susidomėjimą jo naudojimu priono baltymų tyrime (PrPC).

Tačiau, nepaisant didelio proteolitinio stiprumo, yra baltymų, kurie yra atsparūs K. proteinazės poveikiui. Tarp jų yra kai kurie nenormalūs baltymai, vadinami prionais (PrPSc), susiję su užkrečiamomis spongiforminėmis encefalopatijomis..

Indeksas

  • 1 proteinazės K charakteristikos
  • 2 Fermentinis aktyvumas
  • 3 Programos
  • 4 proteinazės K pranašumai
  • 5 Proteinazei atsparūs baltymai K
  • 6 Nuorodos

Proteinazės K charakteristikos

Proteinazė K turi tretinį sluoksnį, sudarytą iš septynių grandinių, kurių tarpas tarp dviejų sluoksnių. Kadangi jis priklauso S8 peptidazių šeimai, jam būdinga katalizinė triada aktyvioje vietoje, kurios eilės tvarka yra (Asp, His ir Ser), kurios jas išskiria iš kitų peptidazių šeimų..

Šis serino proteazių grupės fermentas pasižymi hidrolizuojant peptidines jungtis, esančias netoli alifatinių ir aromatinių amino rūgščių karboksilo grupės..

Kita vertus, ji gali veikti esant tam tikroms ėsdinančioms medžiagoms, tokioms kaip natrio dodecilsulfatas (SDS), Tris-HCL ir EDTA, kurios yra naudojamos baltymų denatūravimui padėti, todėl jie praranda gimtoji struktūra.

Tai yra preliminarus baltymų paruošimo elektroforezės metodui žingsnis. PH intervalas, kuriame proteinazės K veikia gana plačiai (nuo 2,0 iki 12,0), optimalus pH yra nuo 7,5 iki 12,0, o jo izoelektrinis taškas yra 8.9. Kaip galima pastebėti, jis yra aktyvus prieš labai platų pH diapazoną.

Kitas baltymų K išskiriantis požymis yra jo stabilumas esant aukštai temperatūrai (50–60 ° C)..

Fermentinis aktyvumas

Proteinazei K reikia kalcio jonų, nors tai neturi įtakos jo aktyvumui, jei būtina išlaikyti jo stabilumą.

Kad proteinazė K atliktų visą substrato virškinimą, reikia maždaug 5 minučių ir 2 valandų kontakto trukmės..

Tačiau šiuo požiūriu Daza ir kt. Palygino DNR grynumą, gautą kelis kartus veikiant baltymams K, ir padarė išvadą, kad ilgas inkubavimas (iki 24 val.) Žymiai pagerina DNR kokybę..

Dabar, atsižvelgiant į koncentraciją, kuri yra naudojama proteinu K fermento skirtinguose protokoluose, galima teigti, kad jis yra labai įvairus.

Jis gali būti naudojamas nuo labai mažų koncentracijų (5 μg / ml) iki 500 μg / ml koncentracijos. Tačiau dažniausia darbo koncentracija yra tarp 50-100 μg / ml, ypač baltymų virškinimui ir nukleazės inaktyvavimui. Nors audinių gydymui reikalinga 2 mg / ml koncentracija.

Programos

Jos taikymas yra labai platus ir gali būti apibendrintas taip:

-Jis naudojamas baltymų virškinimui ir DNR ekstrahavimui keliais būdais, tokiais kaip: sūdymas, PK-SDS, cetil-trimetilamonio bromidas (CTAB), modifikuotas kalio acetatas ir ekstrahavimas natrio jodidu..

-Nukleazių inaktyvavimas (RNazės ir DNazės).

-Hibridizacijos technikoje in situ (HIS), kad padėtų išlaisvinti nukleino rūgštį, be pašalinių nepageidaujamų baltymų.

-Baltymų modifikavimas.

-Mokslinių tyrimų lygmeniu, įvairiuose tyrimuose.

Baltymų K privalumai

Keletas lyginamųjų tyrimų atlikta tarp DNR ekstrahavimo metodų, naudojant proteiną K, su kitais, kurie jų nenaudoja, ir visi daro išvadą, kad naudojant fermentą yra didesnės naudos. Tarp privalumų galima paminėti:

-Gauti aukštos kokybės aukštos kokybės ir grynos DNR DNR.

-Išgauta DNR yra stabili iki 3 mėnesių.

Išgauta DNR gali būti naudojama šiuose metoduose: Southern blot, polimerazės grandinės reakcija (PCR), elektroforezė, be kita ko.

Baltymai, atsparūs proteinazei K

Įvairūs tyrimai parodė, kad prionai (nenormalūs PrPSc toksiški baltymai) skiriasi nuo PrPC baltymų (natūralių), nes jie yra atsparūs proteinazės K poveikiui, o PrPC yra jautrūs jų poveikiui.

Kiti autoriai aprašė, kad PrPSc struktūroje yra jautrios dalys ir kitos atsparios proteinazui K. Tačiau abi dalys yra vienodai toksiškos ir infekcinės..

Kita vertus, 1987 m. Bastianas ir bendradarbiai, izoliuoti 4, 28, 30, 66 ir 76 kda, baltymus iš Spiroplasma mirum. Visi buvo atsparūs proteinazės K poveikiui ir taip pat turėjo kryžminę reakciją su kai kuriais prionais.

Yra žinoma, kad ši rūšis gali sukelti kataraktą ir svarbius neurologinius pažeidimus, ir dėl kitų Bastiano tyrimų, be kitų tyrimų, buvo bandoma susieti šį mikroorganizmą su užkrečiamomis spongiforminėmis encefalopatijomis..

Tačiau šios degeneracinės neurologinės patologijos etiologija šiandien vis dar priskiriama prionams.

Šiuo požiūriu Butler ir bendradarbiai 1991 m. Nustatė ir apibūdino 40 Kda proteinazei atsparių baltymų K klasę iš dviejų padermių. Mycoplasma hyorhinis. Šis patogenas paveikia kiaules, užkrėstas jų audinius, tačiau šiuo atveju kryžminė reakcija su išbandytais prionais nebuvo.

Norint išsiaiškinti daugybę nežinomų žinių, reikia daugiau tyrimų.

Nuorodos

  1. Bastian F, Jennings R, ir Gardner W. 1987. Antiserumas, susijęs su skrepiumi susijusiu fibrilo baltymu, kryžmiškai reaguoja su Spiroplasma mirum fibriliniai baltymai. J. Clin. Mikrobiolis. 25: 2430-2431.
  2. Daza C, Guillen J, King J, Ruiz V. DNR ekstrahavimo ir gryninimo metodo įvertinimas iš raumenų audinio, fiksuoto formaldehidu iš neidentifikuotų kiaulių..  „Med Magazine“, 2014 m. 22 (1): 42-49,
  3. Butler G, Kotani H, Kong L, Frick M, Evancho S, Stanbridge E ir Mcgarrity G. Proteinazių K rezistentų baltymų identifikavimas ir apibūdinimas Mollicute klasėje. Infection and Immunity, 1991, 59 (3): 1037-1042
  4. López M, Rivera M, Viettri M, Lares M, Morocoima A, Herrera L, et al. Dviejų DNR ištraukimo protokolų palyginimas Trypanosoma cruzi auginamos ašies terpėje. Peru. Med. Exp. Visuomenės sveikata  2014 m. 31 (2): 222-227. Galima rasti adresu: scielo.org
  5. Jiménez G, Villalobos M, Jiménez E ir Palma W. Penkių DNR ekstrahavimo protokolų iš parafino medžiagos efektyvumo nustatymas molekuliniams tyrimams. Rev Méd Univ Kosta Rika. 2007 m. 1 (1): 10-19.