Bakterijų tepinėlio savybės ir paruošimas



The bakterijų tepinėlis yra plonas bakterijų mikroorganizmų suspensijos plėvelės, vykstančios ant skaidrios stiklo plokštės arba skaidres, stebėjimas po optiniu mikroskopu..

Plėvelė plėvelės forma atliekama siekiant kuo labiau atskirti mikroorganizmus, nes jei jie yra sugrupuoti, stebėjimas nėra aiškus.

Tiriant bakterinių kultūrų tyrimus, geriau analizuojami tepinėlių paruošimo, fiksavimo ir spalvinimo metodai. Dėl mažo mikroorganizmų dydžio, jo stebėjimui būtinas optinio mikroskopo naudojimas.

Optiniai mikroskopai yra būtina priemonė tepinėliams stebėti. Jie naudoja optinius lęšius ir šviesą, leidžiančią vizualizuoti mėginius, kurių dydis didėja.

Apskritai, gyvos ląstelės neturi struktūrų, kurios dažniausiai yra spalvotos, matomos per optinį mikroskopą, jos yra bespalviai, skaidrūs mėginiai ir turi labai mažą vidinį kontrastą ir aplinką.

Stebėjimas naudojant paprastą šviesos lauko mikroskopą, nenaudojant pagalbinių dažymo metodų, yra labai ribotas ir naudojamas tik kai kuriais atvejais, kaip ir stebint mikroorganizmų judėjimą..

Siekiant optimaliai stebėti mikroorganizmus, reikia pasiekti pusiausvyrą tarp kontrasto ir skiriamojo gebos. Išsami informacija apie ląsteles negali būti stebima mikroskopu, net esant didelei rezoliucijai; dažų naudojimas reikalingas dažymo metodais, kurie suteikia kontrastą stebėjimui.

Indeksas

  • 1 Geros kokybės bakterijų tepinėliai
    • 1.1 Puikus kontrastas
    • 1.2 Geras nustatymas
    • 1.3 Geras dažymas
  • 2 Paruošimas
    • 2.1 A. Frotis
    • 2.2 B. Tvirtinimas
    • 2.3 C. Paprastas dažymas
    • 2.4 D. Galutinis tepalo išsaugojimas
  • 3 Nuorodos

Geros kokybės bakterijų tepinėliai

Puikus kontrastas

Norint pasiekti puikų kontrastą, vadinami sudėtingi mikroskopai fazinio kontrasto mikroskopas, diferenciniai trukdžiai ir tamsus lauko mikroskopas. Tokio tipo mikroskopas naudojamas bakterijų struktūroms, pvz., Apvalkalams ir gijų, stebėti.

Dažymas yra paprastas būdas padidinti kontrastą, kuris pasiektas skaidraus lauko mikroskopu. Šiuo metodu galima naudoti skirtingus dažiklius, kurie pastebimai pagerina stebėjimą po mikroskopu.

Dėmės yra pagamintos tiesiai ant mikroorganizmų suspensijų tepinėlėmis arba pailgėjimais ant anksčiau išdžiovintų ir fiksuotų skaidrių.

Geras nustatymas

Tvirtinimas yra būdas, naudojamas ląstelių struktūroms išsaugoti; sukelia mikroorganizmų inaktyvavimą ir sukibimą su stikleliu. Yra skirtingi fiksavimo būdai: šilumos fiksavimas ir cheminis fiksavimas.

Šilumos fiksavimas

Tai yra metodas, naudojamas labiausiai stebint bakterijų tepinėlį. Technika susideda iš tepininės bakterinės suspensijos pernešimo žiebtuvėlio liepsna. Šis metodas sugeba išsaugoti bakterijų išorinę morfologiją, bet sunaikina jų vidines struktūras.

Cheminė fiksacija

Cheminė fiksacija naudoja chemines medžiagas, pvz., Formaldehidą arba formaldehidą, etanolį ir acto rūgštį. Cheminių fiksatorių naudojimo pranašumas yra tas, kad pasiektas mikroorganizmų vidinių ląstelių struktūrų išsaugojimas.

Geras dažymas

Dažniausiai anksčiau išdžiovintos ir fiksuotos tepimo dažymo procedūros yra teigiamas arba paprastas dažymas, diferencinis dažymas ir neigiamas dažymas. Taip pat yra specialių metodų tam tikrų ląstelių struktūrų dažymui (kapsulė, sporas, vėliavėlė)..

Teigiamas dažymas arba paprastas dažymas

Teigiamas ar paprastas dažymas yra dažniausiai naudojamas dėmių tepimo būdas. Naudoja dažiklius, kurie gali susieti su tam tikromis mikrobinėmis struktūromis, todėl juos galima stebėti mikroskopu.

Šie dažikliai turi chromoforines grupes (spalvotą dalį) jų cheminėje struktūroje, su kintančiomis dvigubomis jungtimis ir paprastomis jungtimis (konjugacija). Šie ryšiai savo ruožtu gali sukurti jonų arba kovalentinių ryšių su kai kuriomis ląstelių struktūromis.

Dažai, naudojami teigiamame arba paprastame dažyme, dažniausiai yra cheminiai dariniai anilinas (spalvotos organinės druskos).

Kita vertus, tarp dažų mes galime rasti kai kuriuos su baziniu pH ir kitais su rūgštiniu pH.

Pagrindiniai dažikliai

Pagrindiniuose dažikliuose chromoforo grupė turi teigiamą elektros krūvį. Didžioji dauguma prokariotinių mikroorganizmų turi neutralų vidinį pH, o jų ląstelių paviršius yra neigiamai įkrautas. Per šią elektrostatinę sąveiką chromoforas jungiasi prie ląstelės ir ją dažo.

Bazinių dažiklių pavyzdžiai yra metileno mėlyna, violetinė kristalinė, malachito žalia, pagrindinė fuscin, safraninas, be kita ko.

Rūgštiniai dažikliai

Rūgštiniuose dažuose chromoforo grupė turi neigiamą elektros krūvį. Jie naudojami baltymams su teigiamai įkrautomis amino grupėmis dažyti. Rūgščių dažų pavyzdžiai yra rūgšties fuscinas, rožinė Bengalija, raudona raudona ir eozinas.

Diferencinis dažymas

Diferencinio dažymo technika apima dviejų skirtingų spalvų ar intensyvumo dažų, skirtingų mikroorganizmų atskyrimui mikroskopu, panaudojimą. Dažniausiai naudojami bakteriologijos diferencialiniai dėmės yra dažymas ir atsparumas rūgščiai ir alkoholiui.

Gramo dažai naudojami kaip išankstinis bandymas, kad būtų žinoma, kokios formos, dydžio, ląstelių grupės yra, be ląstelių sienelės tipo. Gramo dažymo bandymu bakterijos su ląstelių sienelėmis yra klasifikuojamos kaip gramteigiamos bakterijos ir gram-neigiamos bakterijos.

Neigiamas dažymas

Šiuo metodu naudojami cheminiai dažikliai, kurie neprisiskverbia į ląstelių vidų, tačiau jie daro tai, kad terpė, kurioje mikroorganizmai yra rodomi kaip juodas fonas.

Neigiamo dažymo technikoje tepinėlis atliekamas su kiniško rašalo arba nigrosino suspensijos lašeliu, kuris, leisdamas išdžiovinti kambario temperatūroje, suformuoja neskaidrią šviesą. Tokiu būdu mikroorganizmai tamsiame fone stebimi kaip ryškios formos.

Paruošimas

A. Tepimas

1.- Labai gerai nuplaukite skaidres, išdžiovinkite absorbuojančiu popieriumi ir pažymėkite juos. Etiketėje turi būti nurodytas preparato turinys, data ir asmens, kuris jį apdorojo, pavadinimas.

2.- Šviesinkite žiebtuvėlį ir sterilizuokite inokuliacijos kilpą liepsnoje, kol jis tampa karštas.

3.- Leiskite rankenai atvėsti.

4.- Paimkite bakterijų kultūros mėgintuvėlį, nuimkite dangtelį ir greitai pripilkite mėgintuvėlio burną prie žiebtuvėlio liepsnos (liepsna).

5.- Įdėkite inokuliacijos kilpą vamzdelyje, kuriame yra bakterijų kultūra, ir paimkite mėginį.

6.- Jei kultūra yra skystoje terpėje, mėginį, paimtą rankena, įdėkite į skaidrės centrą ir kruopščiai skleiskite maždaug 2 cm skersmens apskritime.

7.- Inokuliavimo kilpą vėl sterilizuokite.

8.- Leiskite tepalo džiovinimui ore.

9. - Pakartokite 3–8 veiksmus tris kartus.

10.- Jei kultūra yra kietoje terpėje, prieš slydimą reikia įpilti lašo distiliuoto vandens. Tai daroma tam, kad būtų sumaišytas nedidelis kultūros mėginys, paimtas su inokuliacijos rankena, pagal 2–5 etapų nuorodas (asepsis)..

11.- Išskleiskite praskiestą mėginį su vandens lašeliu ant stiklelio ir pakartokite tris kartus.

B. Tvirtinimas

1.- Įdėkite į sausus tepalus, pagamintus iš kultūrų skystoje terpėje, du lašai metanolio arba absoliutaus etanolio..

2.- Leiskite džiovinti ore nuo žiebtuvėlių.

3.- Jei tepinėlis atsiranda iš kietos terpės kultūros, sausas tepalas yra fiksuotas šiluma, praeinant 2–3 kartus greičiau per karščiausią žiebtuvėlio plotą.

4.- Palieskite apatinę tepalo dalį, kai nugarinė kairioji ranka (dešiniarankiams, kitaip naudokite dešinę ranką) ir patikrinkite, ar ji yra šalta.

C. Paprastas dažymas

1.- Įpilkite 2 lašus pasirinkto dažiklio ir leiskite jam veikti tam tikrą laiką, reikalingą kiekvieno dažiklio specifiniuose protokoluose (paprastai nuo 1 iki 5 minučių).

2.- Kai kuriems dažams reikia naudoti šilumą jų aktyvavimui, tokiu atveju būtina būti labai atsargiems šildant stiklą į žiebtuvėlio liepsną (manipuliuoti jį pincetu ir venkite virimo). Tepalo perkaitimas gali sunaikinti norimas stebėti ląsteles.

3.- Pašalinkite perteklinį dažą plaunant distiliuotu vandeniu iš piketės. Nuimkite skalbimo vandenį, atsargiai paspaudę stiklą ant jo krašto, pasvirdami ant darbo stalo.

4.- Leiskite oro džiovinimui.

5.- Atsižvelgiant į stebėjimo tipą, šiame etape naudojamas arba ne. Dangtelis apsaugo ir saugo tepinėlį. Jei stebėjimas atliekamas panardinant į alyvą šiame etape, nenaudojamas dangtelis, tačiau tepinėlis negali būti išsaugotas.

D. Galutinis tepalo išsaugojimas

1.- Įdėkite tepinėlį į kiekvieną iš toliau nurodytų tirpalų mažiausiai 5 minutes. Šių "vonių" paskirtis - palikti tepinėlį visiškai dehidratuotą. Prieš įvedant tepinėlį į kitą vonią, kiekvienas reagentas turi būti nusausintas.

Dehidratuojančių vonių tvarka yra tokia:

  1. Etanolis 70%
  2. 95% etanolio
  3. Grynas acetonas
  4. Sumaišykite acetono-ksilolio 1: 1
  5. Xilol

Tada leiskite džiovinti orą.

2.- Sumontuokite dangtelį, pageidautina 22 × 22 mm, naudojant Kanados balzamą ar kitas surinkimo priemones.

Nuorodos

  1. Briggs, G. (1965). Priežastiniai mikrobiologinių laboratorinių avarijų ir infekcijų veiksniai. JAV armijos biologinės laboratorijos. „Fort Detrick“.
  2. Cappucino, J.G. ir Welch, C.T. (2017). Mikrobiologija: laboratorinis vadovas. Pearson.
  3. Holt, J.G. Redaktorius (1977). Trumpesnis Bergey nustatomasis bakteriologijos vadovas. 8th Baltimorė: The Williams ir Wilkins Co..
  4. Johnson, T.R. ir byla; C.L. (2018). Laboratoriniai tyrimai mikrobiologijoje. Pearson.
  5. Tille, P. (2017). Diagnostinė mikrobiologija. 14th Sent Luisas, JAV: Elsiever, Inc.