Karbamido sultinio pagrindas, paruošimas ir naudojimas

The karbamido sultinys yra skystos kultūros terpė, naudojama tam, kad būtų parodytas fermento ureazės buvimas tam tikruose mikroorganizmuose. Ureazė yra mikroorganizmų fermentas, kuris gaminamas konstitutyviai, ty yra sintezuojamas nepriklausomai nuo to, ar yra substratas, ant kurio jis veikia, ar ne..

Ureazės funkcija susijusi su organinių junginių skaidymu. Ne visi mikroorganizmai gali sintezuoti šį fermentą, todėl jo nustatymas laboratorijoje leidžia nustatyti tam tikras bakterines padermes ir net atskirti tos pačios genties rūšis..

Yra du karbamido tyrimo tipai: Stuart ir Christensen. Jie skiriasi savo sudėtimi ir jautrumu. Pirmasis yra ypatingas, norint parodyti didelį kiekį ureazės, pagamintos pagal Proteus genties rūšis.

Antrasis yra jautresnis ir gali aptikti nedidelius kiekius ureazės, susidariusios vėlyvu laiku, pvz., Klebsiella, Enterobacter, Staphylococcus, Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus, Helicobacter ir Mycobacterium.

Stuart karbamido sultinį sudaro karbamidas, natrio chloridas, dikalio fosfatas, monokalio fosfatas, mielių ekstraktas, fenolio raudonasis ir distiliuotas vanduo..

Kadangi Christensen sultinys arba agaro karbamidas susideda iš peptonų, natrio chlorido, monokalio fosfato, gliukozės, karbamido, fenolio raudono, distiliuoto vandens ir agaro agaro. Pastarasis tik tada, jei tai yra kieta terpė.

Indeksas

• 1 Fondas
  • 1.1 Stuart karbamido sultinys
  • 1.2 Christensen sultinys arba agaro karbamidas
  • 1.3 Abiejų žiniasklaidos priemonių aiškinimas (Stuartas ir Christensenas)
• 2 Paruošimas
  • 2.1 Stuart karbamido sultinys
  • 2.2 Christensen sultinys arba agaro karbamidas
• 3 Naudojimas
• 4 Karbamido tyrimas
• 5 Kokybės kontrolė
• 6 Nuorodos

Fondas

Fermentas ureazė hidrolizuoja karbamidą, kad susidarytų anglies dioksidas, vanduo ir dvi amoniako molekulės. Šie junginiai reaguoja į galutinį produktą, vadinamą amonio karbonatu.

Stuart karbamido sultinys

Stuart karbamido sultinys yra labiau buferinis, kurio pH yra 6,8. Todėl mikroorganizmas turi sugebėti sudaryti didelį kiekį amonio, kad jis taptų raudonas į fenolį. PH turi viršyti 8.

Todėl Stuart karbamido sultinys yra selektyvus Proteus rūšims, todėl 24–48 valandų inkubacijos metu gaunami teigiami rezultatai, ir nėra veiksminga bakterijoms, kurios gamina mažą ureazės kiekį arba lėtai hidrolizuoja karbamidą.

Taip yra todėl, kad „Proteus“ rūšys gali naudoti karbamidą kaip azoto šaltinį. Priešingai, kitoms ureazę gaminančioms bakterijoms reikia papildomo šaltinio.

Tačiau Pérez et al. (2002) nustatė, kad Stuart karbamido sultinys buvo toks pat efektyvus kaip Christensen karbamido agaras, kad nustatytų ureazę Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Trichosporon ir Saccharomyces genčių mielėse..

Tyrimo autoriai teigia, kad jie pasiekė 100% sutapimą su abiem terpėmis (Stuart ir Christensen) inkubuodami 24 ir 48 valandas; su sąlyga, kad jie paėmė teigiamus tempus, kurie sugebėjo paversti žiniasklaidą į stiprią rausvos fuksija spalvą.

Šis paaiškinimas yra būtinas, nes Lodder (1970) patvirtino, kad beveik visos mielės sugeba paversti „Christensen“ karbamido agaro kūgį šviesiai rožine. Taip yra todėl, kad jie gali hidrolizuoti karbamidą minimaliais kiekiais ir aminų susidarymą oksidaciniu amino rūgščių dekarboksilinimu ant paviršiaus. Tai neturėtų būti aiškinama kaip teigiama.

„Christensen“ sultinio arba karbamido agaras

„Christensen“ karbamido sultinys arba agaras yra mažiau buferiniai, todėl gali aptikti nedidelius amonio kiekius. Be to, ši terpė yra praturtinta peptonais ir gliukoze. Šie junginiai sukelia kitus ureazę gaminančius mikroorganizmus, kurie neaugina Stuart sultinyje.

Be to, „Christensen“ karbamido tyrimas suteikia greitesnius rezultatus, ypač „Proteus“, nes jie gali duoti labai teigiamą teigiamą rezultatą kaip tik 30 minučių, kaip minimalus laikas ir iki 6 valandų, kaip maksimalus laikas.

Likę ureazę gaminantys mikroorganizmai sugeba vidutiniškai paversti terpės spalvą po 6 valandų, o po 24, 48, 72 ar daugiau valandų, ir net kai kurie padermės gali sukelti silpnas reakcijas po 5 arba 6 dienų..

Abiejų žiniasklaidos priemonių aiškinimas (Stuart ir Christensen)

Medžiaga iš pradžių yra geltonos oranžinės spalvos, o teigiama reakcija paverčia terpės spalvą rožine fuksija. Spalvos intensyvumas yra tiesiogiai proporcingas pagaminto amonio kiekiui.

Neigiama reakcija palieka pradinės spalvos terpę, išskyrus mieles, kurios gali suteikti šviesiai rožinę su „Christensen“ karbamido agaru..

Paruošimas

Stuart karbamido sultinys

Pasverkite reikiamus gramus pagal komercinio namo nurodymus. Ištirpinkite geriausia steriliu distiliuotu vandeniu. Nenaudokite šilumos, kad ištirptų, nes karbamidas yra jautrus karščiui.

Sterilizavimui naudojamas membraninio filtravimo metodas. Tam naudojamas Millipore filtras, kurio skersmuo yra 0,45 μ. Nenaudokite autoklavo. Kai tirpalas yra filtruojamas, jis paskirstomas steriliuose mėgintuvėliuose. Kad gautų patikimus rezultatus, jis turi būti perkeliamas tarp 1,5 ml mažiausio kiekio iki 3 ml kaip maksimalus kiekis mėgintuvėlyje..

Prieš naudojimą laikyti šaldytuve ir nuplaukite.

Jei filtravimo metodo nėra, terpė turėtų būti naudojama nedelsiant, kad gautų patikimus rezultatus.

Kitas būdas karbamido Stuart sultinio paruošimui yra toks:

Kai kurie komerciniai namai parduoda pusę bazės karbamido tyrimui, neįskaitant karbamido.

Sveriama komercinio namo nurodyta suma. Jis ištirpinamas distiliuotame vandenyje ir sterilizuojamas autoklave 15 ° C temperatūroje 15 minučių. Leiskite jam šiek tiek ilsėtis ir, kai terpė yra šilta, įpilkite 100 ml 20% karbamido tirpalo ir sterilizuojama filtruojant..

Jis paskirstomas steriliuose mėgintuvėliuose, kaip aprašyta anksčiau.

„Christensen“ sultinio arba karbamido agaras

-Karbamido tirpalo paruošimas

Pasverkite 29 g dehidratuoto karbamido ir ištirpinkite 100 ml distiliuoto vandens. Sterilizuoti naudokite filtravimo metodą. Negalima autoklave.

-Karbamido bazinis agaras

24 g dehidratuoto bazinio agaro ištirpinama 950 ml distiliuoto vandens. Autoklave 15 minučių sterilizuokite 121 ° C temperatūroje. Leiskite pastatyti, kol pasiekia 50 ° C temperatūrą, ir prieš tai paruoštą karbamido įpilkite aseptiškai.

Į sterilius mėgintuvėlius įpilkite 4–5 ml ir pakreipkite iki kietėjimo. Turėtų būti ilgas fleita.

Ši terpė taip pat gali būti ruošiama skystos formos.

Naudojimas

Karbamido tyrimas yra labai veiksmingas skiriant Proteus gentį iš kitų Enterobacteriaceae šeimos genčių, atsižvelgiant į greitą reakciją, kurią suteikia Proteus.

Jei naudojama Christenseno sudėtis, bandymas padeda atskirti tos pačios genties rūšis. Pavyzdžiui, S. haemolyticus ir S. warneri sįjungta Staphylococcus koagulazės ir betahemolizės, tačiau jie skiriasi tuo S. haemolyticus tai yra neigiamas karbamidas ir S. warneri tai yra teigiamas karbamidas.

Kita vertus, McNulty sėkmingai naudojo 2% Christensen karbamido sultinio tyrinėjimui Helicobacter pylori biopsijų, paimtų iš skrandžio gleivinės (antralės), mėginiuose.

Buvimas H. pylori tai patvirtina teigiamas karbamido tyrimas. Rezultatų stebėjimo trukmė yra tiesiogiai proporcinga esančių mikroorganizmų kiekiui.

Kaip matyti, tai paprastas metodas diagnozuoti Helicobacter pylori skrandžio biopsijose.

Galiausiai, šis bandymas taip pat naudingas Brucella, Bordetella, Bacillus, Micrococcus ir Mycobacteria genčių rūšims atskirti..

Šlapalo tyrimas

Siekiant optimizuoti rezultatus, du metodai reikalauja stipraus mikrobų inokuliato. Bakterinės kolonijos, pageidautina, yra paimtos iš kraujo agaro ir Sabouraud agaro mielių. Inokuliacija yra emulsinama skystoje terpėje.

Stuart karbamido sultinys, inkubuojamas 37 ° C temperatūroje 24–48 valandas, žinant, kad ieškoma tik Proteus genties padermių, kai štamas yra bakterija. Mielėms jis gali būti inkubuojamas 37 ° C temperatūroje arba kambario temperatūroje 24–48 valandas inkubuojant.

„Christensen“ karbamido sultinio atveju inkubuokite 37 ° C temperatūroje 24 valandas. Jei bandymas yra neigiamas, jis gali būti inkubuojamas iki 6 dienų. Jei bandymas yra teigiamas prieš 6 valandas, tai rodo, kad jis yra „Proteus“ genties štamas.

„Christensen“ karbamido agaro atveju agaro kampas yra stipriai inokuliuojamas be pradūrimo. Sultinys inkubuojamas ir interpretuojamas taip pat.

Kokybės kontrolė

Kontrolinės padermės gali būti naudojamos terpei, pvz Proteus mirabilis ATCC 43071, Klebsiella pneumoniae  ATCC 7006003, Escherichia coli ATCC 25922 ir Salmonella typhimurium.  Pirmieji du turi suteikti teigiamų rezultatų ir du paskutiniai neigiami rezultatai.

Nuorodos

1. Pérez C, Goitía K., Mata S, Hartung C, Colella M, Reyes H. et al. Stuart karbamido sultinio panaudojimas ureazės tyrimui, kaip mielių tyrimas. Soc. Ven. Mikrobiolis. 2002 m. 22 (2): 136-140. Galima rasti adresu: Scielo.org.
2. Mac Faddin J. (2003). Biocheminiai klinikinės reikšmės bakterijų identifikavimo tyrimai. 3-asis red. Redakcinė Panamericana. Buenos Airės Argentina.
3. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. (2009). Mikrobiologinė Bailey & Scott diagnozė. 12 red. Redakcija Panamericana S.A. Argentina.
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004). Mikrobiologinė diagnostika. 5th ed. Redakcija Panamericana S.A. Argentina.
5. Laboratorijos Britanija. Christensen Medio (Urea agaro bazė) 2015. Galima įsigyti: britanialab.com