Restrikcijos fermentų funkcijos, veikimo mechanizmas, tipai ir pavyzdžiai

The restrikcijos fermentai jie yra endonukleazės, naudojamos tam tikrose archaose ir bakterijose, kad slopintų arba „ribotų“ virusų plitimą jose. Jie yra ypač paplitę bakterijose ir yra jų gynybos sistemos dalis prieš užsienio DNR, vadinamą apribojimo / modifikavimo sistema.

Šie fermentai katalizuoja dvigubos DNR pjovimą konkrečiose vietose, pakartotinai ir be papildomos energijos. Dauguma jų reikalauja kofaktorių, pvz., Magnio arba kitų dvivalentių katijonų, buvimo, nors kai kuriems iš jų taip pat reikia ATP arba S-adenozilo metionino..

Apribojimų endonukleazes 1978 m. Atrado Daniel Nathans, Arber Werner ir Hamilton Smith, kurie gavo Nobelio medicinos premiją už atradimą. Jos pavadinimas paprastai kyla iš organizmo, kuriame jie pirmą kartą stebimi.

Tokie fermentai yra plačiai naudojami kuriant DNR klonavimo metodus ir kitas molekulinės biologijos bei genų inžinerijos strategijas. Savo specifinių sekų atpažinimo ypatybės ir gebėjimas sumažinti sekas, esančias arti atpažinimo vietų, daro jas galingomis genetinio eksperimentavimo priemonėmis.

Fragmentai, kuriuos generuoja restrikcijos fermentai, veikę tam tikrą DNR molekulę, gali būti panaudoti originalios molekulės „žemėlapiui“ atkurti naudojant informaciją apie vietas, kuriose fermentas nukirto DNR.

Kai kurie restrikcijos fermentai gali turėti tą pačią atpažinimo vietą DNR, tačiau jie nebūtinai tokiu pačiu būdu nukirpti. Taigi yra fermentų, kurie palieka pjūvius, paliekant nuobodžius galus ir fermentus, kurie sumažina paliekančius darnius galus, turinčius skirtingas molekulinės biologijos taikymo sritis..

Šiuo metu yra šimtai skirtingų komerciškai prieinamų restrikcijos fermentų, kuriuos siūlo įvairios komercinės paskirties pastatai; šie fermentai veikia panašiai kaip "pritaikyti" molekuliniai žirklės skirtingiems tikslams.

Indeksas

• 1 Funkcijos
• 2 Veikimo mechanizmas
• 3 tipai
  • 3.1 I tipo restrikcijos fermentai
  • 3.2 II tipo restrikcijos fermentai
  • 3.3 III tipo restrikcijos fermentai
  • 3.4 IV tipo restrikcijos fermentai
  • 3.5 V tipo restrikcijos fermentai
• 4 Pavyzdžiai
• 5 Nuorodos

Funkcijos

Restrikcijos fermentai tarnauja priešinga polimerazių funkcija, nes jie hidrolizuoja arba nutraukia esterio ryšį fosfodiesterio jungtyje tarp gretimų nukleotidų nukleotidų grandinėje.

Molekulinėje biologijoje ir genų inžinerijoje jie yra plačiai naudojami ekspresijos ir klonavimo vektorių konstravimui, taip pat specifinių sekų identifikavimui. Jie taip pat yra naudingi rekombinantinių genomų konstravimui ir turi didelį biotechnologinį potencialą.

Naujausi genų terapijos pokyčiai verčia naudoti dabartinius restrikcijos fermentus tam tikrų genų įvedimui į vektorius, kurie yra tokių genų transportavimo į gyvas ląsteles transporto priemonės, ir kad greičiausiai gebėjimas būti įvedamas į ląstelių genomą, nuolatiniai pokyčiai.

Veikimo mechanizmas

Restrikcijos fermentai gali katalizuoti dvigubos DNR pjovimą, nors kai kurie sugeba atpažinti vienos grandinės DNR sekas ir net RNR. Iškirpimas įvyksta po sekų atpažinimo.

Veikimo mechanizmas yra fosfodiesterio jungties tarp fosfato grupės ir deoksiribozės hidrolizė kiekvienos DNR krypties pagrinde. Daugelis fermentų gali supjaustyti toje pačioje vietoje, kur jie atpažįsta, o kiti - nuo 5 iki 9 porų porų prieš arba po jo..

Paprastai šie fermentai supjaustomi fosfato grupės 5 'gale, sukeldami DNR fragmentus su 5' fosforilo galu ir galiniu 3 'hidroksilo galu.

Kadangi baltymai tiesiogiai nesiliečia su DNR atpažinimo vieta, jie turi būti perkeliami iš eilės tol, kol jie pasiekia konkrečią vietą, galbūt naudojant „slankius“ mechanizmus DNR grandinėje..

Fermentinio pjovimo metu kiekvienos DNR grandinės fosfodiesterio jungtis yra išdėstyta vienoje iš aktyvių restrikcijos fermentų vietų. Kai fermentas palieka atpažinimo ir pjovimo vietą, tai atliekama per nespecifines trumpalaikes asociacijas.

Tipai

Šiuo metu yra žinomi penki restrikcijos fermentų tipai. Toliau pateikiamas trumpas kiekvieno aprašymas:

I tipo restrikcijos fermentai

Šie fermentai yra dideli pentameriniai baltymai, turintys tris subvienetus, apribojimas, metilinimas ir kitas DNR sekų atpažinimas. Šios endonukleazės yra daugiafunkciniai baltymai, galintys katalizuoti restrikcijos ir modifikacijos reakcijas, jie turi ATPazės aktyvumą ir taip pat DNR topoizomerazę..

Šio tipo fermentai buvo pirmieji atrasti endonukleazai, jie pirmą kartą buvo išgryninti 1960 m..

I tipo fermentai nėra plačiai naudojami kaip biotechnologinis įrankis, nes pjovimo vieta gali būti skirtingu atstumu iki 1000 bazinių porų nuo atpažinimo vietos, todėl jie nepatikimi eksperimentinės atkuriamumo požiūriu..

II tipo restrikcijos fermentai

Jie yra fermentai, susidedantys iš homodimerių arba tetramerių, kurie nukirto DNR tam tikrose vietose tarp 4 ir 8 bp ilgio. Šios pjovimo vietos paprastai yra palindrominės, tai yra, jos atpažįsta sekas, kurios abiem kryptimis yra skaitomos vienodai.

Daugelis II tipo restrikcijos fermentų bakterijose sumažina DNR, kai jie atpažįsta savo užsienio pobūdį, nes jie neturi tipiškų savo DNR modifikacijų..

Tai yra paprasčiausi restrikcijos fermentai, nes jiems nereikia jokių kitų kofaktorių, išskyrus magnį (Mg +), kad atpažintų ir supjaustytų DNR sekas..

II tipo restrikcijos fermentų tikslumas, atpažįstant ir pjaustant paprastas sekas DNR tikslinėse padėtyse, daro juos vienu iš labiausiai naudojamų ir būtinų daugelyje molekulinės biologijos šakų.

II tipo restrikcijos fermentų grupėje yra keli poklasiai, klasifikuojami pagal tam tikras savybes, kurios yra unikalios kiekvienam. Šių fermentų klasifikacija atliekama pridedant abėcėlės raides nuo A iki Z pagal fermento pavadinimą.

Kai kurie poklasiai, labiausiai žinomi dėl jų naudingumo, yra šie:

IIA pakategorė

Jie yra skirtingų subvienetų dimeriai. Jie atpažįsta asimetrines sekas ir yra naudojami kaip idealūs pirmtakai pjovimo fermentų generavimui.

IIB pakategorė

Jie susideda iš dar vieno dimero ir išpjauna DNR abiejose atpažinimo sekos pusėse. Jie nupjauna abi DNR kryptis bazinių porų diapazone už atpažinimo vietos.

IIC pogrupis

Šio tipo fermentai yra polipeptidai, turintys DNR grandinių dalijimo ir modifikavimo funkcijas. Šie fermentai asimetriškai pjauna abi puses.

IIE poklasis

Šio poklasio fermentai yra labiausiai naudojami genetinėje inžinerijoje. Jie turi katalizinę vietą ir paprastai reikalauja alosterinio efektoriaus. Šie fermentai turi sąveikauti su dviem jų atpažinimo sekos egzemplioriais, kad būtų veiksmingai nupjautas. Šiame poklasyje yra fermentai EcoRII ir EcoRI.

III tipo restrikcijos fermentai

III tipo restrikcijos endonukleazės susideda tik iš dviejų subvienetų, vienas yra atsakingas už DNR atpažinimą ir modifikavimą, o kitas yra atsakingas už sekos mažinimą.

Šiems fermentams jų funkcionavimui reikia dviejų kofaktorių: ATP ir magnio. Šio tipo restrikciniai fermentai turi dvi asimetrines atpažinimo vietas, perkelia DNR į ATP priklausomą būdą ir supjauna jį nuo 20 iki 30 bp greta atpažinimo vietos..

IV tipo restrikcijos fermentai

IV tipo fermentai yra lengvai atpažįstami, nes jie nukirpsta DNR su metilinimo žymėmis, jie susideda iš kelių skirtingų subvienetų, kurie yra atsakingi už DNR sekos atpažinimą ir pjovimą. Šie fermentai naudojami kaip kofaktoriai GTP ir dvivalenčio magnio.

Specifinės pjovimo vietos yra nukleotidų grandinės, turinčios metilinto arba hidroksimetilinto citozino likučius vienoje arba abiejose nukleorūgščių kryptyse..

V tipo restrikcijos fermentai

Ši klasifikacija suskirsto į CRISPER-Cas tipo fermentus, kurie identifikuoja ir išskiria specifines DNR sekas nuo invazinių organizmų. „Cas“ fermentai naudoja CRISPER sintetinio orientacinio RNR dalį, kad atpažintų ir atakuotų invazinius organizmus.

Fermentai, klasifikuojami kaip V tipo, yra polipeptidai, struktūrizuoti pagal I, II ir II tipo fermentus. Jie gali pjauti beveik bet kurio organizmo DNR dalis ir su dideliu ilgio diapazonu. Šių fermentų lankstumas ir paprastumas užtikrina, kad šie fermentai šiandien yra viena iš dažniausiai naudojamų genų inžinerijos priemonių, kartu su II tipo fermentais..

Pavyzdžiai

DNR polimorfizmams aptikti buvo naudojami restrikcijos fermentai, ypač tiriant populiacijos genetiką ir evoliucinius tyrimus, naudojant mitochondrijų DNR, siekiant gauti informacijos apie nukleotidų pakeitimų greitį..

Šiuo metu vektoriai, naudojami bakterijų transformavimui skirtingais tikslais, turi daugiakampių vietų, kuriose aptinkamos daugelio restrikcijos fermentų atpažinimo vietos..

Tarp šių fermentų populiariausi yra EcoRI, II, III, IV ir V, gauti ir aprašyti pirmą kartą E. coli; HindIII, iš H. influenzae ir BamHI B. amyloliquefaciens.

Nuorodos

1. Bickle, T. A., ir Kruger, D. H. (1993). DNR restrikcijos biologija. Mikrobiologinės apžvalgos, 57(2), 434-450.
2. Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A. & Horvath, P. (2007). CRISPR suteikia pasipriešinimą prokariotų virusams. Mokslas, 315(Kovo mėn.), 1709-1713.
3. Goodsell, D. (2002). Molekulinė perspektyva: restrikcijos endonukleazės. Kamieninių ląstelių pagrindai vėžio medicinoje, 20, 190-191.
4. Halford, S. E. (2001). Hopping, šokinėjimas ir kontūravimas restrikcijos fermentais. Biocheminės visuomenės sandoriai, 29, 363-373.
5. Jeltsch, A. (2003). Rūšių tapatumo palaikymas ir bakterijų išsiskyrimo kontrolė: nauja funkcija apribojimo / modifikavimo sistemoms? Genas, 317, 13-16.
6. Krebs, J., Goldstein, E., & Kilpatrick, S. (2018). Lewino genai XII (12 red.). Burlingtonas, Masačusetsas: Jones & Bartlett Learning.
7. Li, Y., Pan, S., Zhang, Y., Ren, M., Feng, M., Peng, N., ... Ji, Q. (2015). I tipo ir III tipo CRISPR-Cas sistemų panaudojimas genomo redagavimui. Nukleino rūgščių tyrimai, 1-12.
8. Loenen, W. A.M., Dryden, D. T. F., Raleigh, E.A., & Wilson, G.G. (2013). I tipo restrikcijos fermentai ir jų giminaičiai. Nukleino rūgščių tyrimai, 1-25.
9.  Nathans, D., & Smith, H. O. (1975). Restrikcija Endonukleazės analizuojant ir restruktūrizuojant DNR molekules. Annu. Biochem., 273-293.
10.  Nei, M., ir Tajima, F. (1981). Dna polimorfizmas, nustatomas restrikcijos endonukleazėmis. Genetika, 145-163.
11.  Pingoud, A., Fuxreiter, M., Pingoud, V. ir Wende, W. (2005). Cellular and Molecular Life Sciences II tipo restrikcijos endonukleazės: struktūra ir mechanizmas. CMLS ląstelių ir molekulinės gyvybės mokslai, 62, 685-707.
12.  Roberts, R. (2005). Kaip restrikcijos fermentai tapo molekulinės biologijos darbo žirgais. PNAS, 102(17), 5905-5908.
13.  Roberts, R. J. ir Murray, K. (1976). Apribojimų endonukleazės. Kritinės apžvalgos biochemijoje, (Lapkritis), 123-164.
14.  Stoddard, B. L. (2005). Hominginė endonukleazės struktūra ir funkcija. Ketvirtiniai biofizikos apžvalgos, 1-47.
15.  Tock, M. R. ir Dryden, D. T. F. (2005). Ribojimo ir anti-apribojimo biologija. Dabartinė nuomonė mikrobiologijoje, 8, 466-472. https://doi.org/10.1016/j.mib.2005.06.003
16.  Wilson, G. G., ir Murray, N. E. (1991). Apribojimų ir modifikavimo sistemos. Annu. Genet., 25, 585-627.
17.  Wu, Z. & Mou, K. (2016). Genominiai įžvalgos apie Campylobacter jejuni virulentiškumą ir populiacijos genetiką. Užkrėsti Dis. Vertimas. Med., 2(3), 109-119.
18.  Yuan, R. (1981). Daugiafunkcinių restrikcijos endonukleazių struktūra ir mechanizmas. Annu. Biochem., 50, 285-315.